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【目的】昆虫杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system，BEVS)是当今基因工程领域4大表达系统之一。SARS-3CL，蛋白酶是由SARS冠状病毒编码的一种蛋白水解酶，在SARS冠状病毒的复制中起着重要作用。本实验旨在用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒表达系统，构建3cl基因的重组表达载体，并预期在Sf9 昆虫细胞中表达 SARS-3CL蛋白酶，为筛选SARS-3CL蛋白酶的抑制剂奠定基础。
【方法】用酶切连接方法将3cl基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTB 中，构建成重组转座载体pFB HTB-3CL，经酶切鉴定阳性的重组体转化 DH10BacE.coli感受态细胞，两次蓝白斑初步筛选阳性克隆，双重PCR再次鉴定，抽提大分子质粒DNA并纯化，获得含 SARS-3CL蛋白酶基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-HTB-3CL，脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，待细胞病变后，收集重组杆状病毒颗粒，感染Sf9细胞，上清中病毒用PCR鉴定，收集的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western Blot检测，本实验预期表达的 SARS-3CL蛋白酶将为进一步筛选 SARS-3CL 蛋白酶的抑制剂奠定工作基础。
【结果】利用连接酶成功构建了pFB HTB-3CL重组体，经测序证明插入序列完全正确，重组体经转化 DH10Bac Ecoli感受态细胞，得到重组体 Bacmid-HTB-3CL，蓝白斑筛选到白色克隆为阳性克隆，经双重PCR鉴定证明3CL蛋白酶基因成功转座到杆状病毒载体上，脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，细胞发生明显病变。得到大量的病毒，再次感染后，上清中病毒进行PCR鉴定正确，但提蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及 Western Blot 检测，没有得到预期的蛋白条带。
【结论】成功构建了pFB HTB-3CL重组体，重组体转化DH10Bac Ecoli感受态细胞，3CL蛋白酶基因成功转座到杆状病毒载体上，脂质体介导的转染效果明显，但蛋白的检测效果不明显，实验条件有待进一步探讨，以最终得到 3CL蛋白酶。