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研究目的力与牙周组织的健康密切相关,适宜的力学刺激对于维持牙周组织的健康和调节组织改建必不可少,而不良的力学刺激则会导致牙周组织的破坏吸收。探讨力刺激下牙周组织改建或损伤的内部机理,从而阻止其向病变方向转化并寻求新的治疗靶点,是当代口腔医学着力研究和关注的重点课题之一。本课题在体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)并对其进行牵张加载,观察牵张前后细胞形态和排列的变化,检测其程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)发生率及caspase蛋白表达和蛋白酶活性的变化,探索caspase蛋白酶在牵张诱导HPDLCs发生PCD过程中的作用及调控机制,对于阐明机械力对牙周组织的作用机制具有重要的科学意义。研究方法1.收集因正畸需要拔除的健康前磨牙,刮取根面的牙周膜,采用组织块法进行原代细胞培养,免疫组织化学法鉴定细胞组织来源,通过碱性磷酸酶染色与牙龈成纤维细胞鉴别,获得体外稳定培养的HPDLCs。对体外培养的HPDLCs加载20%动态牵张应变6h和24h,倒置差像显微镜观察加载前后细胞形态及排列的变化。Annexin V/PI双染法和流式细胞术检测牵张加载前后PCD率的变化。2.对体外培养的HPDLCs加载20%动态牵张应变6h和24h,采用免疫印迹技术检测牵张加载前后caspase-3、-5、-7、-8、-9蛋白的表达,采用caspase蛋白酶活性测定试剂盒检测牵张加载前后caspase-3、-5、-8、-9蛋白酶活性的变化。3.特异性阻断caspase-8、-9蛋白酶活性后,对体外培养的HPDLCs加载20%动态牵张应变6h和24h,检测PCD率、caspase-3蛋白表达的变化;特异性阻断caspase-3、-5蛋白酶活性后,检测牵张加载后PCD率的变化;特异性阻断caspase-3蛋白酶活性检测牵张加载后caspase-5蛋白表达及蛋白酶活性的变化;特异性阻断caspase-5蛋白酶活性检测牵张加载后caspase-3蛋白表达及蛋白酶活性的变化;采用免疫共沉淀技术检测牵张加载前后caspase-3与caspase-5的相互作用。研究结果1.利用组织块法在体外成功获得HPDLCs并稳定培养,对细胞加载20%动态牵张应变6h和24h后发现细胞胞体变长,细胞之间呈现出相互平行排列的趋势,其长轴垂直于牵张应变的方向。动态牵张诱导HPDLCs发生PCD,其中6h牵张加载主要诱导细胞发生早期PCD,而24h牵张加载导致更多细胞进入晚期PCD。2.20%动态牵张应变诱导HPDLCs中caspase-3、-5、-7、-8、-9蛋白活化。其中,caspase-3蛋白表达和蛋白酶活性(P<0.05)以及caspase-7蛋白表达(P<0.01)在24h牵张加载后较对照组增加,caspase-5(P<0.01)、-8(P<0.05)、-9(P<0.01)蛋白的表达及蛋白酶活性在6h和24h牵张加载后均较对照组增加。3.同时阻断caspase-8和caspase-9蛋白酶活性可显著抑制6h牵张加载诱导的HPDLCs的PCD率(P<0.01)和活化态caspase-3的蛋白表达(P<0.01),而单纯阻断caspase-9蛋白酶活性或同时阻断caspase-8、-9蛋白酶活性均可显著降低24h牵张加载诱导的HPDLCs的PCD率(P<0.01)和活化态caspase-3的蛋白表达(P<0.01)。分别阻断caspase-3(P<0.01)和caspase-5(P<0.01)蛋白酶活性均可显著抑制牵张诱导的PCD。阻断caspase-5蛋白酶活性可显著降低牵张诱导的caspase-3蛋白表达(P<0.05)和蛋白酶活性(P<0.01),而阻断caspase-3蛋白酶活性则亦可显著降低牵张诱导的caspase-5蛋白表达(P<0.01)和蛋白酶活性(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示牵张加载后,caspase-5与caspase-3之间存在相互作用的关系。结论对体外培养HPDLCs加载20%动态牵张应变,可改变细胞的形态和排列,并诱导PCD的发生,且不同牵张时段可诱导不同阶段PCD的发生。牵张诱导HPDLCs发生PCD的过程中发生了caspase-3、-5、-7、-8、-9的活化,其中caspase-8和caspase-9在不同牵张时段诱导发生不同阶段PCD过程中发挥的作用不同。Caspase-3和caspase-5在牵张作用下彼此之间产生相互作用,但其中的具体作用机制仍有待进一步研究。