A型低聚原花青素的检测、转化研究及应用

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低聚原花青素是广泛存在于植物中的聚多酚类化合物,分为A型和B型两种构型:B型原花青素由单体间的碳碳单键连接而成,A型原花青素则通过碳碳单键和醚氧键双重连接,在自然界中较为少见。与B型不同,A型原花青素除具有极强的抗氧化活性、抗炎活性和保护心血管等生理功效外,还具有独特的抑制大肠杆菌等细菌黏附上皮细胞的功能,能够防治尿道感染。食品来源中A型原花青素主要见于蔓越莓及其制品,而蔓越莓仅产于北美、北欧及我国大兴安岭部分地区,产量有限,价格较高。利用莓类浆果中广泛存在的花色苷,通过对加工工艺及参数的精准调控,促使蓝靛果等原料中含有的花色苷在加工过程中转化生成A型原花青素,是一个既具有理论价值又具有良好应用前景的科学问题。本文在模拟体系中利用花色苷和表儿茶素转化形成A型原花青素二聚体,探索反应条件,研究反应机理,评价生理功效,建立优化了转化方法,并将成果应用到蓝靛果加工过程中,为富含花色苷的浆果的高值化利用提供新方法和新思路。主要研究结果如下:(1)制备不同结构的A型原花青素并建立检测方法。鉴于没有商品化的A型花色苷-表儿茶素纯品,以花色苷和表儿茶素为原料,通过亲核加成反应,转化生成五种A型花色苷-表儿茶素二聚体,产物经过Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相分离纯化,制得A型花色苷-表儿茶素二聚体纯品,采用基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱法鉴定其结构和纯度,确定其分别为A型Cy-Ec、Dpd-Ec、Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut(pC)-5glc-Ec,纯度大于95%。优化建立了超高效液相色谱-串联质谱法,能够在混合体系中同时定性定量检测五种A型原花青素二聚体,在最佳检测条件下,检测限为0.0265–0.0571 mg/L,回收率为85.32%–93.43%,精密度为8.74%–12.67%,该检测方法前处理简单,检测时间短,回收率和精密度均能满足分析要求。在五种常见的市售浆果浓缩汁中,只有蔓越莓浓缩汁中含有A型原花青素二聚体。(2)模拟条件下A型原花青素转化过程中关键因素和控制条件的确定和优化及其反应机理的研究。分别鉴定四种花浆果提取物中花色苷的组成,确定模拟体系的反应原料,建立成分简化的模拟A型原花青素的反应体系;通过对O2、pH值、反应温度、处理时间、原料浓度等多种因素的筛选,运用HPLC-MS手段确证产物中目标组分的存在,优化确定模拟体系中A型原花青素的最优反应条件。结果表明:蓝莓花色苷提取物和表儿茶素反应,生成A型Cy-Ec和Dpd-Ec,由两种脱糖苷产物花青素(矢车菊素和飞燕草素)和表儿茶素直接缩合形成的;蓝靛果提取物、黑果腺肋花楸提取物和黑枸杞提取物与表儿茶素反应,分别检测到A型Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut(pC)-5glc-Ec,由花色苷和表儿茶素发生直接亲核加成反应后生成。(3)探究高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的制备方法。通过优化表儿茶素添加量、pH值、真空度,选择低于模拟体系中的温度并延长浓缩时间,并监测A型原花青素、花色苷、多酚和5-HMF含量以及褐变指数的变化,制备高A型原花青素含量的蓝靛果果汁,最优制备条件为:表儿茶素添加量0.66 g/L,pH 2.8–3.1,真空度200 mbar,加热温度80℃,加热时间100 min。制备工艺实验规模扩大20倍后基本达到实验室工艺的A型原花青素产量。高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁中的A型花色苷-表儿茶素二聚体为A型Cy-3-glc-Ec,含量为620.85±33.09 mg/L,显著高于市售蓝靛果浓缩汁,与蔓越莓浓缩汁中PAC-A2的含量没有显著性差异,但是总原花青素含量低于市售蔓越莓浓缩汁。高A型原花青素蓝靛浓缩汁中总花色苷、总酚、总黄酮、抗坏血酸含量与铁离子还原能力和氧化自由基吸收能力均高于蔓越莓浓缩汁。(4)评价A型花色苷-表儿茶素二聚体及高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁体外防治尿道感染的功效。对比反应原料(花色苷和表儿茶素),A型Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut(pC)-5glc-Ec能够在不影响大肠杆菌生长和细胞活性的低浓度范围(25、50、100、250和500μmol/L)显著影响大肠杆菌生物膜的形成,破坏成熟的大肠杆菌生物膜,抑制大肠杆菌对膀胱上皮细胞的粘附,与PAC-A2无显著性差异,并且能够降低大肠杆菌表面的疏水性,抑制大肠杆菌刺激下膀胱上皮细胞IL-8的分泌和NF-κB p65的诱导活性。同时,高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的防治尿道感染的能力显著高于普通市售蓝靛果浓缩汁,等同于蔓越莓浓缩汁。说明三种A型花色苷-表儿茶素二聚体和高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁对防治尿道感染显示有较好的潜能。综上所述,本研究结果为A型原花青素的高效转化提供了新思路,为其在食品中的应用提供了理论依据;以蓝靛果果汁为原料开发富含A型原花青素的浓缩汁产品,为果蔬的综合加工和功能食品的开发提供了新的思路。
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