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蛋白激酶,又叫蛋白磷酸化酶,是一类通过磷酸化底物行使功能的激酶,蛋白激酶在调节蛋白的活性和稳定性,蛋白分子之间的互作以及亚细胞定位等方面发挥着重要作用。根据结构特点,可分为具有真核生物保守的激酶催化结构域的真核生物蛋白激酶(Eukaryotic Protein Kinase,ePK)和被报道有激酶活性或者与ePK的结构相似的非典型蛋白激酶(Atypical Protein Kinase,aPK)。RIO蛋白激酶家族是13类非典型蛋白激酶中的一类,目前有报道的成员有RIOK-1,RIOK-2,RIOK-3和RIOK-B。RIO蛋白激酶家族成员具有很高的保守性,其中RIOK-1和RIOK-2更是广泛地分布在从古细菌到人体内,证明其二者在生物体内具有非常重要的作用,已经证实RIOK-1和RIOK-2在酵母和人体内参与核糖体的合成和加工,还是保证细胞周期顺利完成的重要因子,RIOK-2更是首例被报道的同时具有可能与核酸结合的wHTH结构及激酶结构域的分子,暗示RIOK-2可能具有多重功能。鉴于RIO蛋白激酶,特别是RIOK-2发挥着如此重要的作用,有学者预测它可能作为良好的药物靶标可用于药物开发。蛋白质晶体学是利用X射线衍射技术,研究蛋白质分子及其复合物、组装体三维结构的统称,是结构生物学的重要组成部分,解析蛋白质的晶体结构,对于阐明蛋白质分子发挥功能的机制以及结构基础,具有十分重要的意义。目前,虽然原核生物荧光古菌和真核单细胞生物嗜热毛壳菌RIOK-2的结构已经被阐明,但遗憾的是,真核多细胞生物RIOK-2的晶体结构尚未能够得到解析,RIOK-2生理状态下的底物仍然未知,为此,本课题进行了以下几方面的研究:(1)粪类圆线虫RIOK-2的生物信息学分析在实验室已获得Ss-riok-2编码区cDNA的基础上,将其氨基酸序列,与已经解析出结构的荧光古菌和嗜热毛壳菌RIOK-2,以及研究较多的人类RIOK-2进行了比对分析,发现RIOK-2保守程度很高,与荧光古菌RIOK-2,嗜热毛壳菌RIOK-2和人类RIOK-2的相似性分别达到15.8%,34.1%和42%,其中,包含了RIO结构域的N端高度保守,差异比较显著的区域集中在C端。(2)粪类圆线虫RIOK-2野生型、D228A突变型、截短型的原核表达纯化构建原核表达载体,在体外成功进行了原核表达并获得高纯度的蛋白(8~10mg/m L)。RIOK-2在纯化过程中非常容易发生降解,但通过野生型和D228A突变型(实验室已证实第228位天冬氨酸是Ss-RIOK-2的催化活性位点)蛋白的纯化对比发现,RIOK-2的降解与其催化活性有无无关;截短表达的RIOK-2只保留了1~329位氨基酸(含wHTH结构和RIO结构域),在纯化过程中证实截短型RIOK-2的降解情况有所改善,但是由于截去了亲水性较高的C端氨基酸,因此蛋白在浓度达到约1 mg/m L以上时即发生沉淀。(3)粪类圆线虫RIOK-2野生型蛋白结晶条件的探索利用商品化的晶体筛选试剂盒进行了结晶初筛,经过多次调整结晶条件之后,得到了疑似晶体的片状结构。对该条件进行重复,以及沉淀剂和盐离子浓度的优化,没有得到与初筛时相同的结果,因此无法确定该片状结构是否是蛋白晶体。(4)抗粪类圆线虫RIOK-2多克隆抗体的制备进行日本长耳白兔免疫实验,制备了抗粪类圆线虫RIOK-2多克隆抗体,用该多克隆抗体免疫印迹粪类圆线虫总蛋白,结果表明制备的多克隆抗体能够识别粪类圆线虫内源RIOK-2,Western blot结果条带单一,特异性良好,能够用于后续的研究。本研究构建了粪类圆线虫Ss-riok-2野生型,D228A突变型,截短型表达质粒,转入E.coli中成功表达,经过纯化得到了纯度很高的重组蛋白;对野生型Ss-RIOK-2进行了晶体筛选;制备了抗Ss-RIOK-2多克隆抗体,经过验证,该抗体具有良好的特异性。这些研究为进一步探索RIOK-2在粪类圆线虫中的功能,以及筛选可能与之互作的蛋白奠定了基础。