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目的：我国每年死于冠心病人数达100多万,缺血心肌的血管新生问题是目前心血管临床急待解决的问题。导师组近年来致力于巴戟天糖链(morinda officinalis oligosaccharidcs,MOO)对缺血心肌的保护及血管新生作用研究。以往对MOO研究发现:MOO可以显著缩小心肌梗死面积,提高缺血心肌微血管密度,明显的减轻缺氧复氧或缺血/再灌注对心肌的损伤,促进鸡胚绒毛尿囊血管生成,显著诱导血管新生过程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、Flt-1蛋白及PDGF-B蛋白的表达。在巴戟天糖链的促血管新生的分子机制方面,导师组以缺氧复氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,证实了MOO可以促进HUVEC细胞增殖,迁移及促进管腔形成。导师组基因芯片研究结果发现,缺血心肌中存在Notch信号通路和PTEN的参与,但其具体机制尚不明确。因此,本实验将继续采用HUVEC细胞为研究对象,探讨Notch信号通路阻断前后,对细胞增殖和细胞周期的影响,及检测MOO诱导下,对Notch信号通路各基因和PTEN的mRNA表达及蛋白变化,进一步探讨MOO在缺血心肌中的分子作用机制,及其诱导下Notch信号通路与PTEN的调控机制,为其在缺血心肌保护方面提供依据。
方法：⑴建立内皮细胞体外缺氧复氧损伤(H/R)模型:取第3代对数生长期的HUVEC细胞,制成单细胞悬液,以适宜细胞密度接种于T-25培养瓶或相应的孔板中,培养24h。弃去原有培养基,PBS洗2遍,缺氧液预先用高纯氮气饱和,37℃缺氧1h;弃去缺氧液,PBS洗2遍,加入复氧液,37℃复氧2h。模型后细胞用于后续试验。⑵检测HUVEC细胞中Notch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN和GAPDH基因表达:收获正常组和缺氧复氧组HUVEC细胞,提取总RNA,反转录cDNA,Q-PCR检测各基因表达量及相对变化。⑶MTT检测DAPT对H/R HUVEC细胞增殖的影响:HUVEC单细胞悬液以1×104/cm2的浓度种于含有1、10、50μmol/L DAPT或含有0.1％(v/v)DMSO的10%胎牛血清的RPMI1640培养液的96孔板中,共4组,每组设置6个复孔。培养24h后构建内皮细胞体外缺氧复氧损伤(H/R)模型后,继续用含DAPT或DMSO培养基培养72h后,采用MTT法检测。⑷流式细胞仪检测DAPT对H/R HUVEC的细胞周期影响:HUVEC单细胞悬液以2×105/瓶的细胞密度接种于T-25培养瓶中,按上述方法造模给药,72h后,流式细胞仪检测细胞周期。⑸检测各组Notch通路及PTEN的mRNA相对变化:HUVEC单细胞悬液以5×106的细胞密度接种于T-25培养瓶中,培养24h。分为四组,正常组、模型组、MOO组、MOO组+DAPT组。建立缺氧复氧模型,进行无血清培养48h后,收获细胞,提取总RNA,反转录cDNA,采用ABI7500 Fast PCR仪,以GAPDH为内参,依据2-△△Ct相对定量法测定mRNA变化。⑹Immunocytochemical检测Notch1蛋白及PTEN蛋白:处理后的盖玻片平铺于六孔板中,以5×105/孔的细胞密度接种,细胞铺满约80%左右,做缺氧复氧模型,分为五组给药,分别为正常对照组,模型组,MOO组,MOO+DAPT组,阴性对照组。继续培养48h后,做免疫细胞化学,拍照,分析结果。⑺计量资料数据采用均数±标准差(-x±s)表示,采用统计学软件SPSS18.0进行方差齐性检验、单因素方差分析,组间用LSD法进行两两比较,取α=0.05作为检验水准。
结果：①Q-PCR检测基因表达结果:HUVEC细胞中Notch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN基因均有表达,缺氧复氧损伤后Notch1、JAG1、DLLA、HES1明显上调(p＜0.05)。②MTT、FCM检测结果显示:10、50μmol/L的DAPT对HUVEC增殖有促进作用(p＜0.05),低浓度1μmol/LDAPT促进作用不明显(p＞0.05)。1、10、50μmol/L DAPT对缺氧复氧HUVEC细胞周期没有显著影响(p＞0.05)。③Q-PCR检测基因相对定量结果:Q-PCR检测mRNA表达,与模型组相比,MOO组Notch1、DLL4、HES1基因mRNA低表达(p＜0.05),PTEN基因mRNA低表达(p＜0.05)。DAPT阻断Notch通路后,PTEN mRNA表达量变化没有显著性差异。④Immunocytochemical结果:Immunocytochemical检测Notch1和PTEN蛋白蛋白表达,采用Biosens DigitalImaging System V1.6软件,选取10个视野,测定阳性区平均积分光密度值(Integrated Option Density,IOD)。与正常组相比,模型组Notch1蛋白黄棕色表达明显升高,IOD值有统计学意义(p＜0.05),PTEN蛋白黄棕色变化则不明显,IOD值没有明显差异(p＞0.05)。与模型组相比,MOO组Notch1蛋白和PTEN蛋白黄棕色表达明显降低,IOD值均有统计学意义(p＜0.05),但DAPT阻断Notch通路后,PTEN蛋白黄棕色表达则变化不明显,OD值没有统计学意义(p＞0.05)。
结论：⑴缺氧复氧损伤可激活HUVEC中Notch信号通路。⑵DAPT对HUVEC有促增殖作用,但对细胞周期没有显著影响。⑶MOO能诱导Notch信号和PTEN低表达。但PTEN可能不为Notch信号的靶基因。