论文部分内容阅读
兽用抗菌药物作为一种新兴的有机环境污染物被全世界范围内的人类所重视。环境中存在的兽用抗生素不仅会诱导环境中耐药基因的产生和转移,还可能会对环境中存在的动物和植物造成毒性效应。第三代头孢菌素类药物头孢噻呋（Ceftiofur,CEF）具有较强的抗菌活性和较低的毒副作用,在全世界范围内被广泛应用于治疗猪、牛、羊等细菌性疾病。目前已有报道在台湾、土耳其等地的环境中检测出头孢噻呋,虽然浓度较低,但存在诱导耐药基因产生的风险。由于人们普遍认为β-内酰胺类药物容易降解,对环境危害较小,因此对于头孢菌素类药物的环境行为研究十分缺乏,需要进行风险评估。本实验按照VICH指南提出的兽用抗菌药物的环境风险评估方法对第三代头孢菌素类药物头孢噻呋进行环境风险评估。主要开展头孢噻呋在环境中的吸附-解吸和降解行为,通过田间堆肥和施肥的方式探究其迁移情况,并根据相关参数预测其在土壤环境中的浓度,通过宏基因组测序的方法揭示其对环境微生物菌群结构以及耐药基因的影响。1.环境样品中头孢噻呋的UPLC-MS/MS检测方法学研究土壤样品使用硼酸缓冲液（p H=9）进行提取,重复提取两次后,使用HLB固相萃取柱进行净化去除土壤中的杂质后,氮气吹干复溶后进行UPLC-MS/MS检测,通过外标法进行定量。粪便样品使用p H=2.5的磷酸缓冲液:乙腈（v:v=1:1）进行提取,重复提取两次后,上清液氮吹去除乙腈后用HLB固相萃取柱进行净化去除猪粪中的杂质,氮气吹干复溶后进行UPLC-MS/MS检测,通过外标法进行定量。此检测方法在1-500μg kg-1的头孢噻呋初始添加浓度范围内线性范围较好（r~2>0.99）,在样品的出峰位置附近没有杂质峰的干扰。土壤样品和粪便样品的检测限（LOD）和定量限（LOQ）是0.3μg kg-1和1μg kg-1。土壤和粪便样品在1μg kg-1、20μg kg-1、500μg kg-1的头孢噻呋的添加浓度下其平均回收率范围为68.6%-89.5%之间,头孢噻呋在土壤和粪便样品的日内变异系数和日间变异系数的范围是3.3%-12.1%。该UPLC-MS/MS检测方法由于操作便捷,回收率高,专属性强,灵敏度好,满足定量分析方法学的要求。2.头孢噻呋在不同土壤中的吸附-解吸特性研究吸附平衡时间实验中将头孢噻呋的初始添加浓度设置为0.05、0.2和0.5μg m L-1作为低、中、高实验组,分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48h进行取样后通过UPLC-MS/MS检测,结果证明头孢噻呋在土壤中的吸附平衡时间为12 h。正式的吸附实验中头孢噻呋的初始添加浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5和1μg m L-1,运用Freundlich等温吸附模型对其吸附行为进行拟合得到吸附常数Kf。结果表明,头孢噻呋的Kf值范围为57.43-122.35μg1-1/n L1/n kg-1,三种土壤中头孢噻呋的吸附强度排序依次为黏土>壤土>砂壤土,其吸附强度与其他类兽用抗生素相比处于中等水平。解吸实验的结果表明,被土壤吸附的头孢噻呋较难发生解吸,解吸强度排序为砂壤土>壤土>黏土,阻滞系数H的范围是1.11-1.36,表明其在三种土壤中有很微弱的阻滞效应,也表明了头孢噻呋具有进入地下水环境的潜力。3.头孢噻呋在土壤和堆肥中的降解和迁移研究研究了实验室内头孢噻呋在土壤中七种不同环境条件下的降解,包括不同初始添加浓度,不同土壤的类型,不同光照强度,不同环境温度,不同田间持水量,不同粪便添加量以及在灭菌土壤中的降解。采用单因素实验的方法,每个实验组只改变其中一个条件,整个实验在人工气候箱中进行。土壤样品分别在0 d、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d采样进行UPLC-MS/MS检测。头孢噻呋在土壤中的降解规律符合一级降解动力学模型,在土壤中七种不同环境条件下的降解半衰期（DT50）范围是0.76-4.31 d。头孢噻呋在土壤的降解会受到多种物理条件的影响,在土壤灭菌实验组中,头孢噻呋的DT50为4.31 d,明显长于未灭菌组,表明头孢噻呋在土壤的降解既包括生物降解,也包括物理降解。收集新鲜猪粪便,一部分在室外使用静态好氧堆肥法进行堆肥,另外一部分作为肥料施于周围田地。添加初始浓度为15μg g-1的头孢噻呋在猪粪便中,在0d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、8 d、12 d、16 d对堆肥和土壤进行采样检测其药物浓度。结果表明,头孢噻呋在堆肥高温期迅速降解,降解半衰期为1.12 d,在第12天降解完全,说明好氧堆肥方式可以有效去除排泄物中的头孢噻呋。土壤施肥实验中在雨天的土壤检测到了头孢噻呋,之后逐渐消散,说明粪便中的头孢噻呋可以通过雨水迁移进周围土壤中。4.土壤中头孢噻呋暴露浓度预测根据欧盟药品评审局（EMEA）提出的环境暴露预测模型,利用相关参数预测头孢噻呋在土壤中的暴露浓度。第一层级的预测暴露浓度为136μg kg-1,需要进行第二层级的评估。第二层级预测暴露浓度在堆肥15天或91天时分别为1.73和1.09×10-10μg kg-1,表明正常堆肥处理15天以上可以有效去除排泄物中头孢噻呋,也说明头孢噻呋不需要进行阶段II的环境效应评估。5.头孢噻呋对堆肥和施肥土壤微生物群落和耐药基因的影响将堆肥0 d、2 d、4 d、10 d的样品和施肥土壤0 d、3 d、4 d、6 d、16 d的样品进行宏基因组测序,结果表明在堆肥样品中主要优势菌门是变形杆菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,假单胞菌属和纤维菌属是堆肥样品中主要的优势菌属。堆肥处理对于粪污中耐药基因的去除具有一定的作用,但是在添加头孢噻呋后其耐药基因丰度增加,说明头孢噻呋对于堆肥耐药基因的产生具有促进作用。施肥土壤样品的宏基因组测序结果表明,在微生物门水平上施肥土壤中主要的菌门是变形菌门、弯曲菌门、酸杆菌门等,在第三天头孢噻呋迁移进土壤之后,发现了厚壁菌门大量繁殖,之后随着药物降解,菌群结构逐渐恢复。土壤样品耐药基因的结果表明,在头孢噻呋进入土壤后,耐药基因丰度增加,之后逐渐恢复,其中多重耐药基因、四环素类和大环内酯类耐药基因占主要地位。本研究充分揭示了头孢噻呋在环境中的迁移转化规律,并评估了其对环境微生物菌群结构和耐药基因的影响,为头孢噻呋的环境安全性评价提供了新的信息,同时为我国今后兽药的环境风险评估方法提供参考。