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β-兴奋剂经常被用作促生长剂影响动物体内的营养成分的重新分配,增加动物酮体瘦肉率,提高饲料转化率,但此类药物在动物可食性组织（肺、肝、肾和肌肉）中的残留会通过食物链影响消费者的健康。中国和欧盟将其划为违禁药物,规定在任何组织中不得检出β-兴奋剂原型及其盐、酯等形式的衍生物。但由于利益驱使,β-兴奋剂的违法使用屡禁不止,且不断有新的兴奋剂替代品出现。2010年3月我国首次从饲料中检出苯乙醇胺A,引起了人们对食品中苯乙醇胺A残留的重视。因此,建立针对苯乙醇胺A残留检测的方法是必要的。目前,苯乙醇胺A的快速检测方法主要是免疫分析法,其灵敏度等性能是由抗体决定的。近年,基因工程抗体由于其周期短、可操作性强和可塑性强等优点为抗体制备提供了一种新的思路。抗体库技术真正实现了体外模拟抗体在机体内部成熟的过程,能简便快速获得抗体,在一定程度上替代了杂交瘤技术,甚至可避免实验动物的使用。噬菌体展示技术是最成熟的抗体展示手段,通过优化筛选及洗脱策略,就有可能获得具有优良特征的重组抗体及基因序列。随后,基于已知的核苷酸及氨基酸序列,结合现代计算机模拟技术可进一步对抗体分子进行体外进化,制备具有理想特性的新型抗体分子,从而进一步推进免疫分析技术的发展。本研究以实验室前期已制备的杂交瘤细胞株（PEAA/2D8）为基础,围绕苯乙醇胺A开展单链抗体的制备,并通过计算机技术模拟单链抗体与苯乙醇胺A的结合模式,分析其关键氨基酸位点及主要作用力,为野生型苯乙醇胺A单链抗体的结构改造提供参考。具体内容如下:（1）体外获得特异性PEAA-scFv-4-13。以实验室前期已制备的杂交瘤细胞株（PEAA/2D8）为材料,利用噬菌体抗体展示技术构建了鼠源噬菌体抗体库,库容量为8×10~8,文库阳性率为83.3%,文库基因多样性良好。通过逐级降低包被原浓度和增加洗涤次数,对噬菌体文库共进行了4轮严苛的淘筛,结合酸洗脱和竞争洗脱两种洗脱方法,最终获得单链抗体及其基因序列（PEAA-scFv-4-13）。对PEAA-scFv-4-13进行大肠杆菌原核表达,通过18℃,200 r/min及0.1 m M IPTG诱导实现可溶性表达。（2）验证了PEAA--4-13的免疫活性。以PEAA-NH2-OVA为包被原,苯乙醇胺A为竞争物质,对PEAA-scFv-4-13进行ic-ELISA,IC50为16.98μg/L,远高于其亲本单克隆抗体（0.63μg/L）;以沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺为竞争物质进行ic-ELISA,测定各药物的IC50值,计算交叉反应率,结果显示PEAA-scFv-4-13特异性强,对其他β-兴奋剂基本不识别,与其亲本单克隆抗体一致。将PEAA-scFv-4-13稀释成工作浓度,储存在4℃和37℃,在0、2、8、14和21 d取出样品,进行间接ELISA。通过0孔OD450值变化考察抗体稳定性。结果显示PEAA-scFv-4-13于4℃条件下储存,活性逐渐下降,可保存14 d左右;于37℃条件下储存,第2 d抗体活性降低50%,稳定性差。综上,PEAA-scFv-4-13基本保留了其亲本单克隆抗体的灵敏度及特异性,但稳定性较差。（3）验证了PEAA-scFv-4-13与苯乙醇胺A相互作用的关键氨基酸位点。利用SWISS-MODEL与Sybyl X-2.0对接软件成功构建PEAA-scFv-4-13与苯乙醇胺A的对接模型。通过分析对接模型得知:F103（N）与苯乙醇胺A的22号氧原子形成氢键,距离为2.88（?）。E174与1号氮原子间存在三种相互作用力,分别是E174（OE2）-N1氢键,E174（OE2）-N1分子间力,E174（OE1）-N1分子间力,距离分别为3.36（?）,3.38（?）,3.36（?）。PEAA-scFv-4-13与苯乙醇胺A之间的相互作用力是氢键和分子间力。通过丙氨酸扫描突变技术和间接ELISA验证F103和E174对抗体亲和力的影响。结果显示F103A,E174A突变体效价低于PEAA-scFv-4-13原型,表明F103和E174为PEAA-scFv-4-13与苯乙醇胺A相互作用的关键氨基酸。对scFv活性口袋进行分析,其主要由VHCDR3,VHFR4,VLFR2,VLFR3构成,有13个氨基酸直接参与了活性口袋的形成。本研究完成了噬菌体抗体表面展示技术的方法学研究,成功制备抗PEAA单链抗体（PEAA-scFv-4-13）,研究了PEAA-scFv-4-13与苯乙醇胺A间的识别机理,为该抗体的体外进化研究提供了基础,从而为动物可食性组织中苯乙醇胺A的快速残留检测方法提供一条新的研究思路。