核恐怖袭击、突发核电站泄漏事故或核战争条件等都极有可能导致人群出现急性放射病(肠型、骨髓型等)甚至死亡。电离辐射可以损伤全身多种组织,但在一定剂量水平上,由于组织细胞的辐射敏感性不同,各器官的反应程度也不同,其中造血组织和肠组织对辐射较为敏感,辐射会导致造血系统和胃肠系统的损伤。飞速发展的核技术在医疗领域也得到了很好的应用,如放射治疗技术已经成为治疗恶性肿瘤的重要手段之一。放疗技术虽然能够针对特定肿瘤部位进行杀伤,但是,该技术的应用仍然会产生副作用一—造成正常组织的损伤,如放射性肠损伤等,这些副作用的产生也极大地限制了放疗有效剂量的使用。如何促进辐射损伤组织的修复仍是当前的研究热点。近年来的研究表明干细胞是组织损伤修复的理想种子细胞。干细胞本身具有极强自我更新能力和定向分化潜能,此外还具有向损伤组织迁移、分化成子代细胞,分泌细胞因子等能力。因此,我们可以在体外调节干细胞的扩增或定向分化,或调节体内干细胞的活性等,使其更好地发挥种子细胞的作用,从而加快辐射损伤组织的修复。我所在课题组前期通过小鼠模型对一系列小分子化合物进行骨髓干／祖细胞调节(动员、募集)能力的筛选时,发现了一种新型的小分子化合物即三(2-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN,缩写为Me6),这种小分子化合物经单次皮下给药后可以快速、有效地将骨髓中的造血干／祖细胞动员至外周血中,将这些动员的造血干细胞移植入辐射损伤的小鼠体内,可以加快其造血系统的恢复。Me6对造血干细胞动员的机制是什么?是否与造血干细胞的增殖有关呢?为了弄清这一问题,我们开展了如下实验：首先,将正常小鼠随机分为对照组(Con组)和Me6组(皮下注射Me6,剂量为5 mg/kg),12小时后,分离两组小鼠的骨髓细胞,利用集落形成实验及流式分析等方法观察Me6对小鼠骨髓细胞中造血干/祖细胞数量的影响。结果发现,Me6组小鼠骨髓细胞中集落形成单位(Colony-forming unit,CFU)的数量和高增殖潜能集落形成单位(High-proliferative-potential CFU, HPP-CFU)的数量明显增加,约为Con组的1.2倍和1.3倍；Me6组小鼠骨髓细胞中造血干/祖细胞表面标志Lin-Sca-l+c-Kit+(LSK)的比例明显增加,约为Con组的1.7倍。这说明Me6能促进小鼠骨髓中造血干/祖细胞的增殖。我们进一步在体外观察Me6是否具有促进造血干/祖细胞扩增的能力。在体外分离小鼠骨髓单个核细胞,分为Con组和Me6组(在培养体系中加入Me6,浓度为100 μM)进行培养。4天后,对细胞数进行计数比较,对细胞中造血祖细胞的集落形成能力进行检测,并通过流式细胞术检测造血干/祖细胞LSK中Ki-67+的比例。结果发现,Me6组细胞中总CFU的数量和HPP-CFU的数量明显增加,约为Con组的1.4倍和1.3倍；Me6组造血干/祖细胞中Ki-67+的比例也显著增加,约为Con组的1.5倍。这些结果提示Me6具有促进正常造血干/祖细胞扩增的能力。为进一步明确小分子化合物Me6是否能促进辐射损伤造血细胞的扩增,我们分离了小鼠骨髓单个核细胞,对其进行3 Gy照射,建立辐射损伤细胞模型。将辐照细胞分为Con组和Me6组(在培养体系中加入Me6,浓度为100 gM)对其进行培养,7天后收集细胞。通过流式细胞术对细胞中Ki-67+的比例进行检测,考察Me6对细胞增殖能力的影响。并通过脾结节形成实验(Spleen colony-forming units at day 12, CFU-S12),来考察Me6对细胞中造血干/祖细胞增殖能力的影响。结果发现,Me6组Ki-67+细胞的比例明显增多,约为Con的1.5倍。Me6组CFU-S12的数量明显增多,约为Con的2.2倍。这说明Me6能促进辐射伤造血细胞的增殖,这些数据进一步支持该小分子化合物具有促进辐射损伤造血系统修复的能力。课题组的前期工作显示,小分子化合物Me6可提高辐射损伤小鼠的生存率,对辐射损伤的小肠组织也表现出促修复的作用。小肠干细胞与造血干/祖细胞虽然起源不同,但是却受到一些相似的信号通路的调节,如Wnt、 Notch通路等。辐射损伤小肠组织的修复是否与Me6对小肠干细胞的调控相关?我们首先用X-射线对IEC-6细胞(大鼠小肠上皮细胞,具有未分化的小肠上皮隐窝细胞的特征)进行5Gy照射,建立了辐射损伤的IEC-6细胞模型。通过CCK-8、流式细胞术检测BrdU掺入、克隆形成等方法,观察了Me6对辐射损伤IEC-6细胞增殖能力的影响。同时也通过AnnexinV/PI染色法,检测了细胞凋亡的情况。结果表明,Me6可以抑制辐射损伤肠上皮细胞的凋亡,促进其增殖；Me6处理后BrdU掺入的比例显著提高,约为Con组的1.5倍；该化合物可以使辐射损伤IEC-6细胞所形成的克隆数明显增多,约为Con组的2.6倍。这些结果提示Me6可能促进小肠干细胞的增殖。为进一步确定小分子化合物是否能促进小肠干细胞的增殖,我们在体外分离了小鼠小肠隐窝细胞。有文献表明,体外分离的小肠隐窝细胞中含有小肠干细胞,通过建立三维的培养体系(在Matrigel中进行培养,加入培养基和所需的细胞因子),可以实现在体外对小肠干细胞的培养。隐窝细胞的出芽代表着小肠干细胞的增殖能力,因此我们可以通过出芽的数量对小肠干细胞的增殖能力进行评估。我们向小肠隐窝细胞的培养液中添加Me6,观察隐窝细胞出芽的数量,并进一步通过流式细胞术检测隐窝中Lgr5+细胞的比例。结果表明,Me6促进了隐窝细胞出芽小体的形成,增加了隐窝细胞出芽的数量,约为Con组的2.5倍；增加了隐窝细胞中Lgr5+小肠干细胞的比例,约为Con组的2.3倍。为探究小分子化合物Me6是否调节小肠干细胞相关基因的表达,我们采用实时定量PCR的方法检测隐窝细胞中一些基因的表达,检测结果表明,Me6增加了隐窝细胞中CyclinD1、Myc、Jun等增殖相关基因的表达,增加了Lgr5、Olfm4、Ascl2、Bmi1等小肠干细胞的相关基因的表达,同时减少了P53、Puma、Bax凋亡相关基因的表达。这些结果说明Me6促进小鼠小肠干细胞的增殖,并减少其凋亡。为了探索Me6促进小肠干细胞增殖的作用机制,我们对小鼠小肠隐窝细胞进行基因芯片分析,发现两组细胞差异表达基因中,Me6组β-catenin调控的靶基因被明显上调表达,在这些靶基因中有一部分是小肠干细胞相关调控基因,这提示我们Me6可能是通过激活β-catenin发挥促进小鼠小肠隐窝细胞增殖的作用。我们进一步通过Western blot验证β-catenin蛋白在IEC-6和隐窝细胞中的磷酸化表达情况,并通过对IEC-6细胞瞬时转染p-catenin siRNA,检测Me6对IEC-6细胞促增殖作用是否受到影响。结果显示,Me6能增加IEC-6细胞中p-GSK-3β和p-β-catenin的表达,促进隐窝细胞中β-catenin的磷酸化；下调β-catenin在IEC-6细胞中的表达后,Me6促进IEC-6细胞增殖的作用受到了抑制。这说明Me6可能是通过激活β-catenin信号通路来发挥促进小肠干细胞增殖的作用。