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肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN），属于转化生长因子β（TGF-β）超家族成员，是骨骼肌生长和发育的负调控因子。研究发现myostatin基因敲除小鼠的骨骼肌重量增加了2-3倍，肌肉组织发生广泛的增生和肥大。Myostatin自然突变的牛也表现出肌肉异常发达的“双肌”表型。Myostatin基因突变小鼠和牛的肌肉重量显著增加，为通过抑制绵羊myostatin基因表达提高绵羊产肉率提供了很好的动物模型。因此，本研究以绵羊myostatin基因为靶基因，分别利用RNA干扰和基因打靶技术制备myostatin失活的转基因克隆绵羊，探索一条提高绵羊产肉率的技术路线，为培育高产肉性能的肉用绵羊新品种奠定基础。同时，本研究对死亡克隆羔羊的各种组织进行了组织学和形态学观察，初步分析了微小RNA（microRNA）在克隆绵羊胎盘中的表达和功能。本文的主要研究内容如下: 1.利用PCR克隆绵羊U6启动子，以EGFP荧光报告系统验证绵羊U6启动子的活性；利用软件设计4个针对绵羊myostatin基因的shRNA（shMSTN），以荧光定量RT-PCR方法筛选有效抑制myostatin基因表达的shMSTN；以电转化法将shMSTN表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞，筛选myostatin基因稳定沉默的绵羊胎儿成纤维细胞；再利用体细胞核移植技术制备myostatin基因沉默的转基因克隆绵羊；利用PCR和westernblot对转基因绵羊进行鉴定；通过称重检测转基因绵羊的日增重情况，利用组织学方法对转基因绵羊肌肉组织进行分析。以上实验结果显示，从绵羊基因组中PCR扩增获得两个绵羊U6启动子（sU6-1和sU6-2），sU6-1和sU6-2含有U6启动子典型的TATA-box、PSE、SPH和OCT结构元件，具有启动shRNA表达的活性，可用于绵羊RNAi的研究；筛选获得一个高效抑制myostatin基因表达的shMSTN3，干扰效率达到87％；经G418筛选获得46个抗性细胞克隆，经PCR鉴定其中12个为阳性克隆，将阳性细胞进行体细胞核移植获得克隆胚胎，胚胎的卵裂率为68%，囊胚率为15%。将克隆胚胎移植到74只受体羊中，35天后有26只绵羊妊娠，其中5只受体羊怀孕足月，出生5只克隆羔羊，其中1只出生后即死亡，1只在出生22天后死亡，另外3只目前健康存活。出生的羔羊基因组中整合有外源shRNA基因，肌肉组织中myostatin表达水平明显下降。转基因克隆绵羊日增重高于对照组，并且肌肉细胞明显肥大。以上研究结果表明，将RNA干扰和体细胞核移植技术相结合可制备myostatin基因沉默的转基因克隆绵羊，为培育高产肉率肉用绵羊新品种奠定基础。 2.利用长片段PCR技术和常规分子克隆技术制备绵羊myostatin基因打靶载体；以电转化法将myostatin基因打靶载体转染绵羊胎儿成纤维细胞，以G418和GANC筛选制备myostatin基因敲除的绵羊胎儿成纤维细胞；再利用体细胞核移植技术制备myostatin基因敲除的转基因克隆绵羊。以上实验结果显示，成功构建了针对myostatin第三外显子的置换型基因敲除载体pNL2-MSTN。共筛选获得25个抗性细胞克隆，PCR鉴定其中3个为myostatin基因敲除的阳性克隆。将阳性细胞核移植后，克隆胚胎的卵裂率为40%，囊胚率为9%。将克隆胚胎移植到22只受体绵羊中，胚胎移植35天后有6只绵羊妊娠，两个月后有5只绵羊返情，另外1只绵羊未获得胎儿，胎儿可能被母体吸收。以上研究结果表明，通过基因打靶技术和体细胞克隆技术可构建myostatin基因敲除成纤维细胞和克隆胚胎，myostatin基因敲除克隆胚胎早期发育良好。本研究初步建立了体细胞基因打靶技术平台，为制备myostatin基因敲除动物奠定了基础。 3.本研究对死亡转基因克隆羔羊各组织器官进行组织学和形态学分析。利用荧光定量RT-PCR方法分析发育相关miR-15、miR-16、miR-21、miR-34a和miR-127在克隆绵羊胎盘中的表达情况。再利用生物信息学软件和EGFP荧光报告系统分析miR-127和miR-21的靶基因。结果显示，死亡克隆绵羊肺不张、发育存在缺陷，同时肝脏、肾脏和脾脏存在不同程度的病变，而克隆胎盘重量和胎盘凸重量高于对照胎盘，克隆胎盘凸的数目少于对照组。与正常对照胎盘相比，发育相关miR-127和miR-21在克隆胎盘中的表达量分别增加3.4倍和5.1倍（P<0.05）；miR-15、miR-16和miR-34a的表达水平在克隆绵羊胎盘与对照绵羊胎盘中差异不显著（P>0.05）。EGFP荧光报告实验初步证实印记基因RTL1和磷酸酶基因（PTEN）分别为miR-127和miR-21的靶基因。以上研究结果表明，转基因克隆绵羊各组织器官发育存在缺陷和病变，为后续体细胞克隆机制研究提供了参考数据。miR-127和miR-21可能通过介导靶基因异常表达引起克隆胎盘发育异常。