论文部分内容阅读
目的:应用超髙效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用(Ultra high Performance Liquid Chromatography/Quadrupole-Time-of-Flight-Mass Spectrometry,UHPLC/Q-TOF-MS)技术研究药物干预前后种植体周围黏膜炎龈沟液的代谢组学特征,寻找种植体周围黏膜炎及其治疗前后的差异代谢产物,进一步寻找种植体周围黏膜炎可能的生物标记物,为临床上预防、早诊断、早治疗种植体周围黏膜炎及种植体周围炎提供理论依据。方法:采集患者的龈沟液(已行牙种植手术并且种植牙冠修复完成半年以上),全部使用滤纸条法采集,分别有健康牙组(A组)15例,健康种植体组(B组)15例,种植体周围黏膜炎组(C组)15例,药物干预后组(D组)15例。从每个组中各随机选取5例样本,应用超髙效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪对龈沟液样本进行检测分析,使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00软件对原始数据进行预处理和归一化处理。然后分别进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(Partial least square-discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)来识别并观察组间差异,上述三种分析都使用SIMCA-P13.0软件。根据OPLS-DA模型的得分图筛选出变量重要性投影(Variable Importance in the Projection,VIP)值(VIP>1.0)的离子,同时结合独立样本t检验(p<0.05)寻找组间差异代谢产物。差异性代谢物的定性方法为:根据准确的相对分子质量,保留时间,离子模式和二级质谱信息,搜索在线数据库metlinlibrary、人类代谢物数据库(humanmetabolomedatabase,hmdb)进行精确的比对。结果:1.临床指标分析结果四个组的探诊深度(probingdepth,pd)、龈沟液重量(peri-implantsulcusfluid,pisf)、改良菌斑指数(modifiedplaqueindex,mpli)、改良龈沟出血指数(modifiedsulcusbleedingindex,msbi)均有统计学差异(p<0.01)。用lsd法进行两两比较,a组、b组以及d组之间没有统计学差异(p>0.05),c组各项指标值均高于a组、b组、d组,且差异有统计学意义(p<0.01)。2.色谱图结果正离子模式下,谱图主要在6—10min有差异;负离子模式下差异主要表现在9—11min。3.pca、pls-da、opls-da分析结果在pca得分图上a组与b组、b组与c组、c组与d组、b组与d组样品在正负离子模式下均不能得到很好的区分,有部分样品重叠;在pls-da和opls-da得分图上,在正离子模式和负离子模式下,a组与b组、b组与c组、c组与d组、b组与d组样品均能够完全区分开,表明各对比组的两组样品之间的代谢成分有明显的差异。4.差异代谢产物鉴定结果与健康牙组相比,健康种植体组呈上调趋势的差异代谢产物有:天门冬氨酸、脱氢鞘氨醇;呈下调趋势的差异代谢产物有:l-胱氨酸、n-硬脂酰脯氨酸。与健康种植体组相比,种植体周围黏膜炎组呈上调趋势的差异代谢产物有:丙氨酸、3-吲哚乙酸、黄嘌呤、天冬氨酸-异亮氨酸、泛酸、脯氨酰缬氨酸、l-甘油磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱(p-16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11z)/p-18:1(9z));呈下调趋势的差异代谢产物有:1,11-十一烷二羧酸。与种植体周围黏膜炎组相比,药物干预后组呈下调趋势的差异代谢产物有:4-羟基异喹胍、n,n-二甲基鞘氨醇、2-棕榈酸、尿石素a-3-o-葡萄糖醛酸、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11z)/p-18:1(9z))。与健康种植体组相比,药物干预后组呈上调趋势的差异代谢产物有:焦磷酸硫胺素、溶血磷脂酰胆碱(20:5(5z,8z,11z,14z,17z)/p-18:1(9z));呈下调趋势的差异代谢产物有:4-羟基异喹胍、c2二氢神经酰胺、脱氢鞘氨醇、2-amino-14,16-dimethyloctadecan-3-ol、1,11-十一烷二羧酸、16β-羟甲基炔诺酮。结论:1.种植体周围黏膜炎是可逆的,改良菌斑指数、改良龈沟出血指数、探诊深度及种植体周围龈沟液量可作为检查种植体周围疾病的常用指标,种植体周围龈沟液量在炎症状态时分泌增多。2.基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联合多元变量统计分析的代谢组学技术是一种没有创伤、快速有效、灵敏的寻找差异性代谢产物的方法,为研究种植体周围黏膜炎以及种植体周围疾病的发病机制提供新思路。3.种植体周围黏膜炎中蛋白质代谢、脂代谢、糖代谢及柠檬酸循环、嘌呤降解途径、磷脂代谢存在异常。4.黄嘌呤、溶血磷脂酰胆碱(P-16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11Z)/P-18:1(9Z))可能是种植体周围黏膜炎潜在的标志物。5.盐酸米诺环素等药物治疗种植体周围黏膜炎两周后,虽然黏膜的临床指标恢复正常,但是仍然存在糖代谢、磷脂代谢和鞘脂代谢异常。