研究背景:转移前微环境是防治肿瘤转移的新靶点,被称为可能引起肿瘤治疗模式变革的重要研究方向。转移前微环境的概念首先由Kaplan在Nature杂志中提出,2016年在Cancer Cell杂志上给予明确定义:一种具有支持性和接纳性的组织微环境,通过一系列分子和细胞改变形成“指定”的转移位点,或为肿瘤细胞(“种子”)提供“肥沃”的“土壤”以利于其种植,从而为肿瘤定植于远端器官提供条件,促进肿瘤转移。转移前微环境的干预成为不能及时或完全切除原位肿瘤的患者预防或减少远端器官转移的重要手段,通过干预转移前微环境以抑制肿瘤细胞转移逐渐成为肿瘤领域研究的热点,被誉为变革肿瘤肿瘤模式的新方向。S1pr1-stat3 激活的髓源性抑制细胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)在转移前微环境构筑及肺转移过程中起到重要的支持作用。肿瘤细胞从原位溢出渗入血管、到达靶器官种植转移是一十分复杂的过程,其中任何一个环节的失败都会阻止肿瘤细胞的转移,研究显示MDSCs在肺转移前微环境中聚集是转移前微环境构建的关键,MDSCs与肿瘤细胞之间的交互作用是循环肿瘤细胞种植转移的关键限速环节。而肿瘤细胞s1pr1-stat3信号通路激活引起的MDSCs细胞相应信号通路活化及转移前微环境中stat3的广泛激活是MDSCs细胞得以在转移前微环境中持续募集及生存的保证。通过干预MDSCs细胞S1pr1-stat3系统而抑制肺转移前微环境形成是抑制肺转移的可靠手段。选择抗肿瘤转移有效的中药方剂,发挥多靶点的优势,干预转移前微环境的形成可能为中药治疗肿瘤提供新的研究方向。中医治疗肿瘤重在从整体上扶助人体正气,预防肿瘤细胞的转移。益气活血法是在临床实践中摸索的抗肿瘤转移的有效方法,在该法指导下结合气机升降理论由花宝金教授创立的双参颗粒(西洋参、冬虫夏草及三七)具有抑制肺转移的临床疗效。且前期的初步实验证实,双参颗粒可显著减少肺中MDSCs的比例。双参颗粒是否通过抑制MDSCs细胞中s1pr1-stat3信号通路的激活起到抑制肺转移前微环境形成的作用是本研究的主要内容。揭示双参颗粒干预肺转移前微环境抗肿瘤转移的机制对进一步配伍提高抗肿瘤转移效率的研究有重要意义。且从理论上为中医治未病,“先安未受邪之地”的理论提供了实验基础及科学依据,对中医治疗肿瘤模式的变革具有现实意义。研究目的:理论研究:以气机升降理论为指导的益气活血方剂在“先安未受邪之地”思想指导下抗肿瘤转移的作用机制研究。实验研究:分析气机升降理论与益气活血法结合创立的双参颗粒,探讨其在干预转移前微环境防治肿瘤转移中的作用,开展如下实验:(1)体内实验:①观察双参颗粒通过干预转移前微环境对荷瘤小鼠原位肿瘤及肺转移的影响,②研究双参颗粒对肺转移前微环境中MDSCs以及其s1pr1/stat3信号通路的影响③研究双参颗粒对肺转移前微环境特异性肿瘤源性细胞因子(tumor-derived secreted factors,TDSFs)的作用;④双参颗粒对转移前微环境生物标记物(Fibronectin,Lox,Versican,MMP9)表达的影响。(2)体外实验:①探讨双参颗粒对肿瘤细胞分泌肺特异性TDSFs的作用,②在明确肿瘤细胞s1pr1-stat3信号通路激活对MDSCs分化影响之后,探讨双参颗粒对该过程的干预作用,③体外建立共培养模型,模拟转移前微环境,探讨双参颗粒对转移前微环境特异性生物标记物表达的作用。总体而言,探讨气机升降与益气活血结合指导的双参颗粒干预肺转移前微环境抗肺转移的效果及其相关机制。研究方法:(1)构建Lewis肺癌C57BL/6小鼠肺转移模型,采用小动物活体成像和定期取材(肺、瘤体)两种方法,观察双参颗粒对原位肿瘤及肺转移的影响。(2)利用荧光显微镜、免疫组化、酶标仪荧光定量3种方法评估转移前微环境动物模型的构建。(3)利用ELISA方法,检测肺转移前微环境与转移微环境中肺特异性TDSFs(VEGF、TGF-β、GM-CSF 及 TNF-α)的表达水平。(4)利用流式细胞检测仪定量分析肺转移前微环境中MDSCs的比例及表型变化。(5)Western blot、免疫组化染色方法评估肺转移前微环境中转移前微环境特异性生物标记物的水平。(6)利用共培养技术构建转移前微环境体外模型,观察双参颗粒醇提剂对模型中TDSFs、转移前微环境特异性生物标记物的影响。(7)在共培养模型中,明确s1pr1-stat3信号通路激活的Lewis细胞对髓系细胞向MDSCs分化的作用,及双参颗粒的干预效果。研究结果:(1)双参颗粒抑瘤效果:小动物活体成像结果显示:双参颗粒组及5-FU组均可明显抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr(P<0.05);14d天双参颗粒有较明显的抑制原位肿瘤生长的作用p/sec/cm2/sr(P<0.05),28d与对照组比较,原位肿瘤质量相似(P>0.05);5-Fu组在28d时仍有较显著的抑制瘤体作用(P<0.05)。(2)抑瘤率:在接种Lewis细胞后第14d、28d分别处死小鼠,剥离瘤体称重计算抑瘤率:在14d、28d时双参组和5-Fu的抑瘤率分别为38.2%、4.2%;41.8%、20.1%。(3)肺转移:接种 Lewis 细胞后第 14d、17d、20d、23d、26d、29d、32d、35d分别处死小鼠,采用布氏液处理后肉眼观察转移灶、冰冻切片荧光显微镜观察、组织研碎酶标仪荧光定量分析、石蜡包埋切片HE染色观察4种方法评估肺转移情况,26d前双参颗粒组和5-Fu组均较对照组转移减少(P<0.05),29d后双参颗粒组和对照组肺转移相似(P>0.05)。(4)肺中MDSCs比例:和对照组相比,双参颗粒组小鼠肺中MDSCs比例显著降低(33.9%vs.9.9%,P<0.O5)。(5)血中肿瘤源性分泌性细胞因子:采用ELISA法,定量分析接瘤后14d、28d小鼠血中VEGF、TGF-β、GM-CSF及TNF-α的表达水平,结果和对照组相比,14d时SSG只对GM-CSF和TNF-α有促进恢复正常的作用(P<0.05),对VEGF、TGF-β无显著作用;28d时SSG可显著降低血中TGF-β、GM-CSF的表达水平(P<0.05),对VEGF及TNF-α无显著影响。(6)肺转移前微环境中特异性生物标记物:Versican、Fibronectin、Lox、MMP9被认为是和肺转移前微环境相关的生物标记物。我们采用免疫组化染色方法、Western blot定性和定量评估各指标的表达情况,两种方法的结果基本一致,双参颗粒治疗组较对照组均有显著的下降(P<O.05)。5-Fu与双参组无显著优势(P>0.05)。(7)双参颗粒对体外转移前微环境模型中TDSFs的影响:在共培养模型中分别观察12h、24h共培养上清液中TDSFs的变化,发现共培养12h时各组TDSFs较对照组无显著变化(P>0.05)。24小时后TGF-β及GM-CSF在双参颗粒组有显著降低(P<0.05),VEGF和TNF-α无显著变化。5-Fu对各种TDSFs均无显著抑制作用。(8)双参颗粒对s1pr1-stat3信号通路的作用。我们用实时定量荧光PCR方法检测s1pr1、stat3基因在各相关组织(肺、骨髓、肿瘤)细胞的表达情况,同时用western blot方法进行验证。我们发现双参颗粒对肿瘤组织、骨髓组织及肺脏组织中两种基因及蛋白的表达均有抑制作用(P<0.05)。5-Fu只对肿瘤组织中两种基因及蛋白的表达有抑制作用(P<0.05),对骨髓及肺中两种基因及蛋白的表达作用不明显(P>0.05)。(9)双参颗粒对髓系细胞向MDSCs分化的作用:首先,我们通过sew2871(s1pr1激活剂)激活Lewis细胞s1pr1-stat3信号通路。激活的Lewis细胞和髓系细胞共培养,流式细胞仪结果显示MDSCs占髓系细胞的比例较对照组明显增加(43%vs.5%,P<0.05)。其次,我们观察了双参颗粒对MDSCs分化的影响,发现野生Lewis细胞对MDSCs分化作用不明显,双参颗粒作用也不显著;而双参颗粒醇提剂可通过抑制Lewis细胞s1pr1的表达,从而抑制髓系细胞向MDSCs细胞的分化(43%vs.0.7%)。5-Fu有相同的效果,两组和对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。(9)双参颗粒对体外转移前微环境模型中肺转移前微环境特异性生物标记物的作用:通过对模型中肺细胞和MDSCs细胞混合物做western blot检测,我们发现,和单纯的肺细胞或MDSCs对照组相比,双参颗粒对转移前微环境模型中 Version、Fibronectin、Lox、MMP9 均有抑制作用(P<0.05)。研究结论:(1)气机升降理论指导的益气活血方剂双参颗粒不仅对原位肿瘤有一定的抑制作用,还可通过调控转移前微环境防治肿瘤细胞在远端靶器官种植转移。(2)双参颗粒可有效减少肺转移前微环境中MDSCs的含量及降低肿瘤细胞分泌的部分TDSFs。(3)Lewis肺癌细胞s1pr1-stat3信号通路的激活与骨髓细胞向MDSCs的转化、肺脏s1pr1-stat3激活有关。双参颗粒通过降低肺转移前微环境中s1pr1-stat3信号通路的激活程度及MDSCs在肺脏转移前微环境中的聚集,减少转移前微环境标记物Version、Fibronectin、Lox、MMP9的表达水平,逆转肺转移前微环境,减少肿瘤细胞肺转移。