改良雌核发育草鱼群体的建立及其遗传特性研究

来源 :湖南师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:aiyis88
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国产量最高的重要养殖经济鱼类,2018年其年产量达550万吨(2019年中国渔业统计年鉴)。然而,连续人工自交容易导致草鱼种质资源退化,造成其染病及死亡。为了获得遗传改良草鱼,本研究通过雌核发育技术,首次使用灭活的锦鲤精子作为刺激源激活草鱼成熟卵子,经过染色体加倍处理后获得改良雌核发育草鱼,建立了改良雌核发育草鱼群体,并对其遗传等生物学特性进行了系统研究。1.首次采用紫外辐射灭活的锦鲤精子激活草鱼成熟卵细胞,通过冷休克处理抑制第二极体排出使其染色体加倍获得改良雌核发育草鱼,建立了改良雌核发育草鱼群体(1310尾),为其遗传等生物学特性的研究提供了宝贵的实验材料;也为其在生产上的应用奠定了重要种质资源。2.对改良雌核发育草鱼的外形、红细胞、染色体数目等特性进行了系统研究。在外形方面,改良雌核发育草鱼身体呈淡青绿色或淡茶黄色,头部稍扁平,口端位,吻部稍钝,无口须,与普通草鱼具有一致性;在红细胞方面,改良雌核发育草鱼与普通草鱼的红细胞形态、DNA含量等特征无显著差异(P>0.05);在染色体数目方面,改良雌核发育草鱼具有48条染色体,核型为18m+24sm+6st,与普通草鱼一致,确定其为二倍体草鱼。综上所述,改良雌核发育草鱼与普通草鱼在多种生物学特征上具有一致性。3.对改良雌核发育草鱼的分子遗传特性进行了系统研究。1)利用微卫星DNA分子标记,在改良雌核发育草鱼中找到了灭活的锦鲤精子残留的特异性微卫星DNA片段(MFW1-G),该片段仅存在于改良雌核发育草鱼与锦鲤中,而普通草鱼中没有。这是首次在分子生物学的水平提供了改良雌核发育草鱼中存在父本遗传物质的重要证据,为雌核发育后代中的“杂交效应”提供了依据,也为区分改良雌核发育草鱼与其它草鱼品种提供了分子标记。2)利用9对引物(HoxA4a,HoxA9a,HoxA11b,HoxB1b,HoxC4a,HoxD10a,HoxC6b,HoxC6b-G和HoxC6b-K)在锦鲤、改良雌核发育草鱼以及普通草鱼Hox基因簇中共扩增出32个Hox基因以及2个不属于Hox基因簇的DNA片段(K522)。对扩增出的32个Hox基因以及K522进行测序分析发现,改良雌核发育草鱼具有一个兼有双亲遗传结构且偏向于锦鲤的HoxC6b-GGC-2重组基因,同时它还具有与草鱼相同的HoxC6b-GGC基因以及与锦鲤相同的HoxC6b-GGC-1基因。此外,引物HoxC6b扩增结果中,还在改良雌核发育草鱼和锦鲤扩增出一条不属于Hox基因簇的K522,在普通草鱼中没有扩增出该DNA片段。测序结果显示,在改良雌核发育草鱼与锦鲤中扩增出的K522具有完全相同的序列。HoxC6b-GGC-2是首次在改良雌核发育草鱼中发现的重组基因,该基因的发现进一步提供了改良雌核发育草鱼中存在父本遗传物质的重要证据,进一步证明了雌核发育鱼的“杂交效应”。3)对锦鲤、改良雌核发育草鱼和普通草鱼的线粒体DNA和5S rDNA序列结构进行了比较分析,研究结果显示改良雌核发育草鱼具有与普通草鱼相同的线粒体DNA以及5S rDNA序列结构,在这些遗传结构方面,两者之间具有相似性。4)基于转录组测序技术及生物信息学分析,对改良雌核发育草鱼和普通草鱼的肝脏和脾脏转录组进行了测序及比较分析,共筛选出改良雌核发育草鱼与普通草鱼之间的3145个差异表达基因,包括1666个表达上调基因以及1479个表达下调基因。对这些差异表达基因进行了GO富集以及KEGG信号通路富集分析,根据富集到的功能基因以及信号通路,推测了改良雌核发育草鱼不易染病可能的原因。5)为了探究改良雌核发育草鱼的生物膜屏障功能,选取紧密连接信号通路对转录组测序结果进行验证分析,其中比较分析了改良雌核发育草鱼和普通草鱼肝脏、脾脏以及肠道组织中9个紧密连接蛋白相关基因(occludin、claudin15a、JAM、claudin2、claudin7a、claudin4、ZO-1、cingulin、sympk)的表达量。实时荧光定量核酸扩增分析结果与转录组分析结果一致:改良雌核发育草鱼紧密连接蛋白相关基因表达量高于普通草鱼;说明改良雌核发育草鱼紧密连接蛋白发挥了更强的生物学功能,具有更强的生物膜屏障功能,进而推测出改良雌核发育草鱼通过增强生物膜屏障功能降低其染病的风险。
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