论文部分内容阅读
目的:将负载前胸腺素(ProTα)多肽片段,具有温度敏感性的聚合物胶束用于负载STAT3-siRNA到达肿瘤相关树突状细胞(TADCs),下调STAT3蛋白的表达,调控肿瘤相关树突状细胞的功能,发挥其体内免疫抗肿瘤效果。方法:通过酰胺键反应合成壳聚糖接枝的泊洛沙姆(PO-CS)载体,采用FT-IR和1H-NMR进行结构验证,并用芘探针测量其形成胶束后的临界胶束浓度。在溶液中形成胶束后,利用马尔文粒径电位测定仪中测量其粒径和电位大小,同时测量15℃,25℃和37℃条件下胶束的粒径变化考察其温度敏感性。本实验还分别测量了泊洛沙姆(PO)、壳聚糖(CS)以及PO-CS载体在不同温度下的粒径变化情况来考察该胶束的温度敏感性来源。将制备好的胶束置于透射电镜(TEM)中观察其表面形态,并通过琼脂糖凝胶电泳验证胶束对siRNA的保护作用。利用MTT的方法考察胶束对树突状细胞(DCs)、脾脏细胞(Spleen Cells)和293T细胞的安全性;并使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察PO-CS胶束负载ProTα和siRNA进入DCs的情况及聚合物胶束温度敏感性的考察。利用Western Blot方法检测负载STAT3胶束与TADCs共培养后STAT3蛋白的下调情况,同时使用流式细胞仪检测STAT3-siRNA发挥沉默效果后,ProTα促进TADCs表达CD40,CD86及IL-12的情况。采用IVIS Lumina II小动物成像仪观察胶束负载Cy5-siRNA的体内动态情况,使用红外热成像仪考察胶束体内冷刺激所需的时间。建立B16黑色素瘤肿瘤模型考察负载ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS载体的体内药效学效果。结果:本实验所构建PO-CS载体容易形成胶束,CMC较低(5.0μg/ml)。TEM结果表明,PO-CS胶束外观圆整,粒径为231.7±4.6nm,电位为17.3±0.3mV,PI值较小,对siRNA的包封率达90%以上,且具有一定的温度敏感性。MTT结果显示,PO-CS胶束的DCs细胞毒性低,并且其负载的siRNA在树突状细胞中的摄取(81%)要比巨噬细胞(25%)高。激光共聚焦显微镜结果表明,ProTα/PO-CS胶束能很好地将siRNA转运到TADCs中,并且具有很好的温度敏感性,能在冷刺激的作用下实现siRNA的释放。Western Blot结果表明,胶束负载的STAT3-siRNA能有效沉默TADCs中STAT3蛋白的表达,并且能在流式细胞仪中观察到ProTα促进TADCs中表面成熟因子CD40,CD86的上调,而未加STAT3-siRNA处理组并无此功能。该结果表明共负载STAT3-siRNA和ProTα处理后,TADCs的功能得到恢复,能向成熟树突状细胞分化。IL-12因子的上调结果也证明经共负载STAT3-siRNA和ProTα胶束治疗后,TADCs恢复正常的功能。体内小动物成像结果表明,胶束负载siRNA后,持续长时间观察到Cy5-siRNA的体内动态情况。红外热成像结果表明,体内达到冷刺激效果温度所需的时间为20-25min。体内肿瘤生长抑制实验结果表明,与PBS组相比,负载ProTα和STAT3-siRNA的ProTα-PO-CS冷刺激胶束组能很好地调控TADCs的功能,发挥免疫抗肿瘤效果,抑制肿瘤的生长,同时释放更多的IL-12,共同抑制肿瘤的生长。结论:ProTα-PO-CS温度敏感性胶束能将siRNA递送到TADCs中,沉默STAT3蛋白的表达,调控TADCs的功能,恢复ProTα促进树突状细胞向成熟树突状细胞分化的功能,发挥联合免疫抗肿瘤的治疗效果。