黑素皮质素受体3(The melanocortin-3receptor，MC3R)属于G蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptors，GPCRs)，其立体构象中有七次α螺旋跨膜区。该受体被证实在维持动物机体能量平衡、维持钠平衡、参与免疫反应和调节机体昼夜节律等方面起到重要作用。　　目前，有关人、小鼠和猪等哺乳动物的MC3R及其突变体的体外活性研究已有报道，但对于禽类的MC3R，目前的研究主要集中于基因多态性和经济性状间的关系，而关于禽类MC3R以及其突变型的生理活性的研究较少。　　为了更深层次的研究鸡MC3R(cMC3R)的功能，了解受体和配体的相互作用规律，同时为进一步的药物筛选或育种优化等提供依据，我们构建了cMC3R的真核表达载体，并根据已有研究报道中基因多态性与经济性状的关系选取了四个突变位点即:M54L、G104S、L151R和S183S，通过单点突变技术获得这四个突变体，将这5个真核表达载体分别转入人肾上皮细胞系（Human Embryonic Kidney T cells，HEK293T)中，利用流式细胞仪检测不同基因型受体的胞内总表达和细胞表面表达水平;利用125I标记的NDP-MSH进行放射性配体受体结合实验研究cMC3R WT和四个突变与不同配体的结合能力;利用双报告基因法和Western Blot测定了激动剂作用下cMC3R WT(wild type)和四个突变体对胞内环磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)与磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(phosphorylated Extracellular regulated protein kinases1/2，pERK1/2)水平的影响，以此了解cMC3R基因突变对其受体体外生理功能的影响。　　结果如下:　　1、设计特异性扩增引物，得到cMC3R WT全长序列，将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体得到pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT。利用点突变技术以pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT质粒为模板构建单点突变，成功获得4个突变型cMC3R的真核表达载体。　　2、将野生型和突变型cMC3R真核表达载体分别转染至HEK293T细胞中，流式细胞仪测定蛋白表达，TritonⅩ-100将细胞膜打孔检测胞内总蛋白表达水平，不打孔的细胞检测细胞表面表达水平。结果显示，cMC3R四个突变体的细胞表面表达和胞内总表达与WT相比均无显著性差异。　　3、用瞬时表达野生型和突变型cMC3Rs的细胞进行放射性配体受体竞争结合实验，分别用激动剂NDP-、α-、β-、γ-、和D-Trp8-γ-MSH与拮抗剂AGRP与125I-NDP-MSH竞争结合受体。结果显示G104S突变几乎丧失与各配体结合的能力，L151R与配体的亲和力显著上升，M54L和S183S的配体结合能力与WT无显著性差异。　　4、将野生型和突变型cMC3R真核表达载体与萤火虫荧光素酶报告质粒和海肾荧光素酶报告质粒按固定比例转入HEK293T细胞，检测胞内基础cAMP水平，结果显示，M54L和S183S的胞内基础cAMP水平与WT相比无显著性差异，G104S和L151R与WT相比显著性下降;同时分别选用不同浓度水平的激动剂或拮抗剂在转染后进行刺激再检测胞内cAMP水平，在不同浓度配体的刺激下，WT cCM3R的cAMP水平随着激动剂浓度的增加而上升、随着拮抗剂浓度的上升而下降，在同样浓度的配体刺激下，M54L和S183S的活性与WT cMC3R相似，而G104S和L151R对配体响应的灵敏度下降。　　5、将带有野生型和突变型cMC3Rs基因转染HEK293T细胞，提取总蛋白，利用Western Blot检测胞内磷酸化ERK1/2基础和配体诱导后的蛋白表达量。结果显示，G104S的胞内磷酸化ERK1/2水平与WT相比有明显下降，但经过配体诱导后的四种突变的磷酸化ERK1/2水平则与野生型没有显著性差异;M54L、L151R和S183S的磷酸化ERK1/2水平与WT cMC3R无显著性差异。同时发现AGRP是一种cMC3R的偏向激动剂。