[目 的]分析溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）粘膜愈合前后血清、粪便氨基酸和肠道菌群变化,探索亮氨酸（Leucine,Leu）、肠道菌群与UC粘膜愈合的关系,阐明Leu在UC粘膜愈合中的作用和机制。旨在从氨基酸代谢联合宏基因角度研究UC粘膜愈合的机制,为预测UC粘膜愈合提供新的生物标记物和改善饮食结构治疗UC提供理论依据。[方 法]本研究分为临床、动物、细胞三个部分:第一部分（临床层面）:纳入经英夫利昔单抗诱导达到粘膜愈合的UC患者15例,采用靶向代谢组学检测粘膜愈合前后血清和粪便氨基酸浓度,结合粪便钙卫蛋白（Fecal calprotectin,FC）,绘制受试者工作曲线（Receiver operator characteristic curve,ROC）,评估不同氨基酸预测UC粘膜愈合的价值。采用宏基因组学分析粪便肠道菌群变化,生物信息学分析差异菌群关联功能基因和代谢通路。第二部分（动物层面）:构建葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）诱导小鼠结肠炎模型,采用缺乏亮氨酸和完全氨基酸饲料喂养小鼠,评估各组小鼠疾病活动指数（Disease Activity Index,DAI）、结肠、脾脏病变,H＆E染色评估炎症程度,运用RT-PCR、Western blot和免疫组化检测肠道紧密连接蛋白Claudin-4、Occludin、ZO-1的转录和表达水平,ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β的表达水平。第三部分（细胞层面）:1.缺乏和 250μmol/L Leu 培养 Caco-2 细胞,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激模拟炎症环境。2.采用CCK8法、Transwell法及流式细胞仪检测细胞增殖、迁移及凋亡水平,Western blot检测NF-κB通路TLR4、MyD88、P65、p-P65蛋白和肠道紧密连接蛋白Claudin-4、Occludin、ZO-1的表达水平,检测mTORC1信号通路中的关键蛋白mTORC1、S6K、4E-BP1的表达及磷酸化水平;ELISA法检测各组细胞上清TNF-α、IL-1β的表达水平。3.抑制亮氨酸感知关键信号通路蛋白mTORC1,检测步骤2中的相关指标。[结 果]第一部分（临床层面）:1.靶向代谢组学结果显示与活动期UC患者相比,粘膜愈合后患者粪便中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸含量明显降低（P＜0.05）。而血清中丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸含量明显升高,天冬氨酸明显降低（P＜0.05）。2.ROC诊断试验显示粪便16种氨基酸预测UC粘膜愈合具有一定价值,曲线下面积（Area under curve,AUC）均＞0.7,其中谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸预测UC粘膜愈合的准确性高,AUC＞0.9。粪便Leu与FC呈正相关,相关系数r=0.831,其预测UC粘膜愈合AUC=0.9289,采用347.35μg/g为截断值预测MH的敏感度为86.7%,特异度为93.3%。3.宏基因组测序结果示在门分类水平上,活动期UC以厚壁菌门（Fitmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和子囊菌门（Ascomycota）为主,粘膜愈合后厚壁菌门和拟杆菌门比例明显增加,占主导位置。在属分类水平上,UC以拟杆菌属、肠球菌属（Enterococcus）、酵母菌属（Saccharomyces）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主,粘膜愈合后以拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、氏菌属（Roseburia）和梭菌属（Clostridium）为主。在种分类水平上,UC以屎肠球菌（Enterococcus faecium）和大肠杆菌（Escherichia coli）为主,粘膜愈合后以普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）为主。4.UC粘膜愈合前后菌群比较:在门水平上,UC粘膜愈合后55种菌门增加,以拟杆菌门尤为明显,而变形菌门降低。在属水平上,UC粘膜愈合后535菌属增加,以拟杆菌属、氏菌属、梭菌属、优杆菌属（Eubacterium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、布劳特氏菌（Blautia）、副杆状菌属（Parabacteroides）尤为明显,41菌种下降。在种水平上,UC粘膜愈合后2495菌种增加,如脆弱拟杆菌（Bacteroidesfragilis）、普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）,329 菌种下降,如粪肠球菌。5.主成分分析、无度量多维标定法和主坐标分析显示:UC粘膜愈合前后菌群结构在不同水平上均存在明显差异。6.LEfSe分析结果:在各个微生物的分类水平上共检测到89个差异项。其中14个在UC富集,75个在MH富集。在菌属水平上,发现15个菌属是可以区分UC和MH的潜在标记物,其中1个在UC富集,14个在MH富集。在菌种水平上,发现57个菌种是可以区分UC和MH的潜在标记物,其中10个在UC富集,47个在MH富集。以下菌种在UC粘膜愈合后显著升高并具有临床意义:p厚壁菌门（Firmicutes）→c梭菌纲（Clostridia）→o梭菌目（Clostridiales）→f瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）→g粪杆菌属（Faecalibacterium）→s普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）;p拟杆菌门（Bacteroidetes）→c拟杆菌纲（Bacteroidia）→o拟杆菌目（Bacteroidales）→f拟杆菌科（Bacteroidaceae）→g拟杆菌属（Bacteroides）→s脆弱拟杆菌（Bacteroidesfragilis）;p厚壁菌门（Firmicutes）→c梭菌纲（Clostridia）→o梭菌目（Clostridiales）→f优杆菌科（Eubacteriaceae）*g优杆菌属（Eubacterium）→s霍氏真杆菌（Eubacteriumhallii）。7.KEEG数据库注释分析显示:碳水化合物和氨基酸代谢是肠道微生物数量最多的功能基因。共有1273个KO功能类群丰度在UC粘膜愈合前后存在显著性差异,其中135个KO在UC中明显富集,与炎症、免疫相关,粘膜愈合后1138个KO富集,与代谢、遗传信息处理相关。8.KEGG三级分类水平结果显示59条代谢通路在UC富集,以碳水化合物代谢、膜运输为主,粘膜愈合后82条代谢通路富集,以碳水化合物代谢、聚糖生物合成与代谢、氨基酸代谢、能量代谢、脂肪酸生物合成、核苷酸代谢、辅助因子和维生素代谢为主。9.KEGG显示UC粘膜愈合中Leu生物合成明显增加,以酮醇酸还原异构酶尤为明显,与拟杆菌属、瘤胃球菌属、优杆菌属、氨基酸球菌属（Acidaminococcus）、另枝菌属（Alistipes）、普拉梭菌等菌种密切相关。第二部分（动物层面）:1.动物实验中发现缺乏Leu饲养组小鼠DAI评分升高、结肠缩短、脾脏增大、结肠大体评分和H＆E评分增加;DSS诱导后缺乏Leu饲养组小鼠上述指标变化更为明显;补充Leu后,DAI评分进行性下降、结肠长度恢复、脾脏回缩、结肠大体评分和H＆E评分明显下降（P＜0.01）。2.缺乏Leu饲养组小鼠血清TNF-α、IL-1β表达升高,DSS造模后升高明显,补充 Leu 后 TNF-α、IL-1β明显下降（P＜0.01）。3.缺乏Leu饲养组小鼠Claudin-4、Occludin、ZO-1表达降低,DSS造模后,表达量进一步减少,补充Leu后表达明显升高（P＜0.01）。第三部分（细胞层面）:1.缺乏Leu培养的细胞增殖、迁移活性稍下降,存在少许凋亡,LPS刺激后细胞增殖活性、迁移明显降低,凋亡率增加（P＜0.05）。2.缺乏Leu培养的细胞TLR4、MyD88、p-P65表达增加,TNF-α、IL-1β表达升高,LPS刺激后,TLR4、MyD88、p-P65表达明显增加,TNF-α、IL-1β明显升高（P＜0.05）。3.缺乏Leu培养的细胞Claudin-4、Occludin、ZO-1表达降低。LPS刺激后,Claudin-4、Occludin、ZO-1 表达明显降低（P＜0.05）。4.缺乏Leu培养的细胞p-mTORC1、p-S6K、p-4E-BP1表达降低,LPS刺激后,p-mTORC1、p-S6K、p-4E-BP1 表达量明显降低（P＜0.05）。5.抑制mTORC1后,细胞增殖活性、迁移下降,凋亡增加,TLR4、MyD88、p-P65 表达上调,TNF-α、IL-1β 表达升高,而 p-S6K、p-4E-BP1、Claudin-4、Occludin、ZO-1表达下调（P＜0.05）。[结 论]1.UC粘膜愈合前后粪便氨基酸存在显著差异,其中Leu预测MH的敏感度和特异度均较高,有潜力成为一种预测UC粘膜愈合的新型辅助生物标记物。2.UC粘膜愈合前后肠道菌群存在显著差异,粘膜愈合后肠道微生物多样性增加,肠道菌群结构改变,以普拉梭菌、脆弱拟杆菌、霍氏真杆菌等为主的产短链脂肪酸（Short chain fatty acid,SCFA）菌种明显增加。3.UC粘膜愈合后氨基酸代谢通路富集,如Leu生物合成明显增加,可能通过影响肠道微生物,如瘤胃球菌属、氨基酸球菌属、另枝菌属、普拉梭菌,进而影响碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂肪酸生物合成等多条代谢通路,产生SCFA和支链脂肪酸,参与肠上皮代谢,促进UC的粘膜愈合。4.缺乏Leu饲养小鼠出现炎症和肠道屏障受损,DSS造模后加重,补充Leu后缓解,提示Leu可通过抗炎和增强肠道屏障参与UC的粘膜愈合。5.Leu通过激活mTORC1信号通路促进细胞增殖、迁移和抗凋亡、抑制NF-κB通路发挥抗炎和促进蛋白合成以增强肠道屏障功能,参与UC粘膜愈合。