ETT2转录因子eivF调控禽致病性大肠杆菌致病性的机制研究

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong545
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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)作为一种常见的致病菌,常与其他病原菌相互作用,引起禽大肠杆菌病。因其血清型复杂,致病因子众多,其防治仍是重大难题。因此,加强对禽致病性大肠杆菌的研究,对养殖业发展和公共卫生安全具有重要意义。ETT2是大肠杆菌重要的毒力岛,参与细菌毒素分泌与运输等致病过程。转录因子eivF隶属于ETT2毒力岛,目前eivF仅在肠出血性大肠杆菌和肠聚集性大肠杆菌中有初步研究,发现其可调控LEE毒力岛分泌,参与细菌黏附等过程。迄今为止,eivF尚未在禽致病性大肠杆菌等其他大肠杆菌中进行研究。本研究利用Red同源重组方法构建禽致病性大肠杆菌ETT2转录因子eivF缺失株和回复株,评价其对APEC生物学特性的影响,并利用RNA-Seq技术筛选缺失株显著差异表达基因,筛选受eivF调控的潜在靶点,最后通过致病性试验评价eivF对APEC致病力的影响。本研究为后期深入研究ETT2功能和禽致病性大肠杆菌致病机制提供研究基础。主要的研究内容和结果总结如下:1、APEC eivF缺失株和回复株的构建及对其生物学特性的影响通过PCR检测和氨苄青霉素和氯霉素筛选,证明APEC 81菌株中含有目的基因eivF。利用Red同源重组技术构建APEC eivF缺失株,使用低拷贝质粒p STV28构建eivF回复株。生长曲线测定结果显示,与野生株AE81相比,缺失株AE81ΔeivF的生长性能无显著差异。药物敏感试验结果显示,野生株AE81和缺失株AE81ΔeivF药物敏感性均无显著变化。运动性检测结果表明,野生株AE81形成较大的运动圈,缺失株AE81ΔeivF运动圈明显变小,缺失eivF后其运动能力减弱,回复株基本恢复至野生株状态,形成较大的运动圈。透射电镜观察到野生株AE81鞭毛细长且多,缺失株AE81ΔeivF鞭毛数量明显减少,回复株AE81ΔeivF-comp有较多的鞭毛。生物被膜试验结果表明,野生株AE81成膜能力较强,可形成完整的生物被膜,且膜表面光滑平整,缺失株AE81ΔeivF生物被膜完整且膜表面出现明显褶皱,回复株AE81ΔeivF-comp膜表面出现轻微褶皱。扫描电镜发现野生株AE81生物被膜平整致密,且细菌之间粘连紧密,缺失株AE81ΔeivF生物被膜空间结构更为复杂立体,有类似于三维塔状结构的孔道,回复株AE81ΔeivF-comp生物被膜平整光滑致密,无孔道结构。耐酸和过氧化氢敏感试验结果显示,与野生株AE81相比,缺失株AE81ΔeivF的耐酸能力和抗过氧化氢杀菌能力均显著减弱(P<0.05)。2、APEC野生株与eivF缺失株的RNA-Seq分析通过RNA-Seq技术筛选缺失株AE81ΔeivF差异表达基因,共筛选到576个显著差异表达基因,其中上调基因368个,下调基因208个。GO功能分析发现共有38个功能得到注释,涉及的功能主要有细胞过程、代谢过程、定位;细胞和细胞组分、膜和膜组分;催化活性、结合、转录活性等。KEGG通路分析显示,差异基因主要富集通路是鞭毛组装、不良环境中微生物代谢、ABC转运蛋白、抗生素生物合成、双组分系统、碳代谢、群体感应、大肠杆菌生物被膜等。结合研究内容一中鞭毛和生物被膜等生物表型均出现显著差异,从转录组数据中筛选与鞭毛组装和生物被膜形成相关的差异基因,发现鞭毛差异基因主要涉及鞭毛Ⅱ级和Ⅲ级调控基因,如flg B、flg C、flg D和mot A等。生物被膜差异基因主要涉及与生物被膜形成相关的转录调控基因,如mcb R、csg D和mlr A等。筛选部分差异表达基因,进行反转录实时荧光定量PCR检测,结果显示它们转录水平趋势与转录组数据一致。3、eivF缺失对禽致病性大肠杆菌致病力的影响通过溶血性试验、血清杀菌、细胞黏附和体内分布试验探究eivF对禽致病性大肠杆菌致病力的影响。溶血性试验结果表明,缺失eivF后,缺失株AE81ΔeivF溶血状态无显著变化。血清杀菌试验结果表明,缺失株AE81ΔeivF在10%、20%、30%和40%血清浓度下,其抗血清杀菌能力无显著变化,但在50%血清浓度下其抗血清杀菌能力显著增强(P<0.05),回复株AE81ΔeivF-comp与野生株相比无显著差异。鸡胚成纤维细胞黏附试验结果显示,与野生株AE81相比,缺失株AE81ΔeivF黏附细胞的能力极显著增强(P<0.001),RT-q PCR检测发现缺失株的tsh、bcf A、ibe A黏附相关基因的转录水平均极显著上调(P<0.001),fim C无显著变化。体内分布试验发现,缺失eivF后,缺失株AE81ΔeivF在雏鸡的心、肝、脾和肺组织中的定植数目显著增多。综上所述,本研究成功构建eivF缺失株和回复株,缺失eivF后,AE81菌株的运动能力、耐酸和过氧化氢敏感显著降低,生物被膜形成、抗血清杀菌能力、细胞黏附和体内组织载菌量均显著增强,对生长性能和溶血性无显著差异,eivF影响鞭毛、生物被膜和黏附等基因的转录水平。表明eivF参与调控APEC生物表型和致病作用,其可能通过调控鞭毛、生物被膜和黏附基因进而影响APEC致病过程。
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