SpliInx1和SpliInx4与先天免疫抑制相互关系的研究

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无脊椎动物innexin (inx)基因是生物进化上高度保守的基因,区别于脊椎动物的connexin。 Inx基因可在细胞膜表面形成功能性的通道蛋白hemichannel,并与信号传导,胚胎发育,神经系统分化等功能相关。本研究在斜纹夜蛾Spodoptera litura血细胞转录组数据中发现了特异的inxl, inx4序列,通过RT-PCR克隆出了Splilnxl, Splilnx4,经过比对,确定它们都属于保守的inx基因家族。具有四个保守跨膜结构,两个胞外环一个胞内环,一个位于第二个跨膜结构域前端的YYQWV基序及在胞外环上各有2个半胱氨酸残基。其中,Splilnxl开放阅读框全长1086bp,编码361个氨基酸;Splilnx4开放阅读框全长1116bp,编码371个氨基酸。构建了包含ORF全长编码区的原核表达载体及真核表达载体,经Western blot证明Splilnxl和Splilnx4均可在大肠杆菌及鳞翅目昆虫High Five,Sf9和Spli221细胞系中表达。实时荧光定量PCR检测了SpliInxl, SpliInx4在血淋巴,神经,脂肪体,中肠,卵巢和精巢中的表达分布。提取了被双斑侧沟茧蜂寄生后0-7天的斜纹夜蛾血淋巴,用实时荧光定量PCR检测了inxs基因,p53,p110, CypD在被寄生后的表达量,探讨了inxs基因与P13K信号通路及其它与凋亡相关基因在先天免疫抑制过程中的表达变化。同时发现了SpliInx4对于斜纹夜蛾生殖系统发育的重要作用。而后构建了inxs基因的稳定表达细胞系,证明了inxs的表达均定位于细胞膜,而且在细胞质蛋白中SpliInx3的表达最为明显,在对细胞内磷酸根的荧光探针检测中发现inx蛋白在细胞内均有磷酸化现象。在转染过程中发现SpliInx1和Splilnx4导致了Sf9和Spli221细胞系凋亡,抑制PI3K/AKT信号通路,激活了Caspase途径导致凋亡。最后我们模拟了病毒感染细胞实验,构建了Bac-inx2和Bac-inx3病毒载体,并通过荧光探针发现SpliInx3去磷酸化作用最为明显,磷酸根离子与细胞凋亡密切相关。
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