肝细胞肝癌(HCC)是一种恶性度极高的常见肿瘤,通常发现较晚而病情发展迅速,其发生、发展均不是十分清楚。肝癌细胞发生凋亡,即程序性死亡,是一种由基因调控的自主性自身破坏过程,可使细胞形态发生改变、DNA断裂和蛋白发生交联。凋亡细胞数量减少是肿瘤产生的根本原因之一。细胞增殖与凋亡失衡是肿瘤形成和发展的一个重要机制,该过程涉及多个基因的改变,并受着复杂的信号转导网络系统的调节。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个串联的杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat, BIR),C端含或不含有一个环指(RING finger)结构。FLIP是新近发现的IAP家族中的一个重要成员,近年来的研究表明FLIP具有强大的抗细胞凋亡作用,并在维持细胞有丝分裂以及血管形成过程中扮演重要角色。FLIP(即FLICE inhibitory protein,也称为CASH,Casper FLIP,CLARP,FLAMME MRI)是近年来发现的一类含有死亡效应结构域(death efectdomains, DED)的凋亡抑制蛋白,在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在。已证实FLIP与炎症、肿瘤、自身免疫性疾病的发生、发展有关,在人类多种常见肿瘤中存在高表达,提示FLIP与多种人类肿瘤的形成和发展有着密切关系。肿瘤细胞凋亡的减少与肿瘤的发生、发展的密切相关。并且使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因而,诱导肿瘤细胞凋亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。FLIP定位于2q33-34,是一个凋亡抑制基因,属于IAP家族。FLIP具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能。它抑制凋亡的作用是通过与凋亡效应分子caspase-8直接结合实现的。而肿瘤细胞内高表达FLIP使其不受Fas/FasL介导的凋亡作用并逃避免疫监视是肿瘤增殖、恶化的重要原因。所以可以抑制Fas、Bax、caspase分子和抗肿瘤药物引起的凋亡。FLIP是一个天然存在的caspase-8抑制蛋白,它缺乏催化活性所必需的关键的半胱氨酸结构,是Fas介导的细胞凋亡的负调节蛋白,降低FLIP的水平可以致敏肿瘤细胞对Fas和TRAIL介导的细胞凋亡。然而,调节FLIP表达的分子机制还未完全明确.因此对FLIP分子调节机制的研究将有助于进一步了解与FLIP相关疾病的发生机制,并对临床治疗这些疾病提供一个新的思路。RNA干涉(RNA interference,RNAi)是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的转录后基因沉寂(PTGS)现象。外源的双链RNA(dsRNA)在细胞内一种被称为Dicer的核酸酶的作用下,首先被剪切成含19-23个核苷酸对的小RNA片段,称为小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)。后者与Dicer和其他一些蛋白质共同构成RNA诱导的沉寂复合物(RISC),依靠碱基互补规律识别与siRNA同源的mRNA分子,并将它们降解。目前RNAi作为一种高效特异地抑制基因表达的新技术,已广泛应用于基因功能和基因治疗等研究中。在肿瘤基因治疗中,通过人工合成特定癌基因靶向的siRNA,或构建上述siRNA的表达载体,并将它们导入肿瘤细胞中,可以特异性地抑制目的基因的表达。本实验是利用免疫组化和RNAi技术研究FLIP在肝脏组织及肝癌组织表达和意义。研究目的:研究FLIP在肝脏组织及肝癌组织不同分级中的表达,并观察人肝癌细胞Hepg2和SMMC-7721细胞系中siRNA对FLIP表达的抑制作用和与凋亡的关系。研究方法:1.免疫组织化学法检测FLIP表达分析46例肝癌标本,27例肝硬化组织标本,18例肝脏血管瘤标本,12例正常肝组织标本,10个肝癌Hepg2细胞系细胞爬片标本中LFIP蛋白的表达。应用FLIIP的抗体对上述患者的组织切片进行免疫组织化学染色并进行统计学分析。2. FLIP表达与肝癌组织分级的关系分析86例肝癌标本(采用经典的Edmondson四级分级法,I级18例,II级25例,III级21例,IV级22例),肝癌Hepg2和7721细胞系2株细胞爬片的10个样本中FLIP蛋白的表达并进行统计学分析比较。3. RNAi载体的构建及鉴定根据Flip mRNA序列,选取针对Flip mRNA526～544,1164～1182,1305～1323处序列的3个RNA干扰靶位点,设计并合成寡核苷酸序列,将合成的单链寡核苷酸溶解退火成双链DNA。pSUPER载体用Bgl II,Hind III酶切后与上述双链DNA连接,16℃孵育过夜,转化大肠杆菌DH5α菌株,筛选阳性菌落提取质粒酶切鉴定并测序正常。4.重组载体干扰效率分析人肝癌细胞7721、Hepg2与宫颈癌细胞Hela在含10g/L小牛血清的1640培养基中进行培养。取处于对数生长期的7721、Hepg2与Hela细胞,2.5g/L胰酶消化后,按一定的密度接种于6孔培养板中,次日应用Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂进行转染。24h后传代,加入浓度为400μg/mlG418筛选,四周后挑取多个单集落扩大培养。对各组细胞进行HE染色、透射电镜等形态学观察。应用RT-PCR、间接免疫荧光法、TUNEL法检测细胞凋亡、western-blot分别检测FLIP的mRNA和蛋白的水平变化与凋亡的关系。分别取2×106个转染pSUPER-S1的人肝癌细胞7721、Hepg2细胞和阴性对照细胞分别接种于裸鼠(各6只)皮下,进行裸鼠体内成瘤实验。研究结果:1.肝脏组织FLIP的表达凋亡抑制蛋白FLIP在46例肝癌标本中有39例阳性表达(84.73%),在10例肝癌Hepg2细胞系细胞爬片标本全部阳性表达(100%),27例肝硬化标本中4例阳性表达(14.81%),30例肝血管瘤和正常肝组织中2例阳性表达(6.67%),其余均为阴性(P<0.01)。2.不同肝癌组织分级FLIP表达差异凋亡抑制蛋白FLIP在86例肝癌标本中有72例阳性表达(83.72%),I级13/18(72.22%),II级20/25(80.00%),III级18/21(85.71%),IV级21/22(95.45%)(P﹤0.05);在肝癌Hepg2、7721细胞系细胞爬片10个样本中全部阳性表达(100%),(P<0.01)。3. pSUPER重组质粒酶切鉴定重组质粒用BglⅡ和HindⅢ双酶切,阳性质粒应该能够切下一长度大约为60bp的片断。而对照组空质粒(对照是针对来源于深海水母增强绿色荧光蛋白( EGFP)的一段序列,与人无同源性,作为无关序列对照)由于BglⅡ和HindⅢ两个酶切位点相邻,不能切出片断。酶切后用2%的琼脂糖凝胶电泳,结果显示三对siRNA的寡核苷酸重组表达载体均有阳性克隆。DNA测序结果也证实重组质粒中已插入目的片段。阳性质粒分别命名为pSUPER-S1、pSUPER-S2、pSUPER-S3。4. RT-PCR和Western-blot对干涉表达载体效率的鉴定在mRNA及蛋白水平上,三个重组载体均有不同程度的干涉效果,尤其以pSUPER-S1最为明显,效率至少在70%以上。通过免疫组化、凋亡等功能研究发现,转染pSUPER-S1的人肝癌细胞SMMC-7721、Hepg2组部分细胞变得较大而扁平,并失去短梭形的特点,其它细胞形态上未见明显变化。TUNEL法检测细胞凋亡显示,转染pSUPER-S1组细胞凋亡率较对照组增加5倍;在荧光显微镜下,转染pSUPER-S1组部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率达47.3%;透射电镜显示转染pSUPER-S1组中部分细胞存在典型的凋亡形态,而对照组凋亡细胞较少。5.裸鼠体内成瘤实验14天后对照组6只全部成瘤。4周后,对照组平均瘤体积为740mm,而转染pSUPER-S1组仅有2只有可在皮下触及很小的瘤体,直径约为1.3mm,其余4只未见肿瘤生长。转染pSUPER-S1的人肝癌细胞SMMC-7721、Hepg2细胞组体内成瘤能力显著下降。结论:1.凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌组织中阳性表达明显,在良性肝组织中阳性表达不明显。2.凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌组织中呈阳性表达;不同分化的肝癌组织其表达阳性率不同,分化越差起阳性表达率越高。3.应用RNA干涉载体,可以在细胞内形成特异性siRNA抑制FLIP的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。利用RNAi技术抑制FLIP表达可能为揭示肝脏恶性肿瘤的发生、发展提供新的理论依据,并为肝癌的有效治疗提供新的思路。