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本研究用改进的RT-PCR法合成人肝脏cDNA,构建出cDNA文库,并从中分离出人胰岛素样生长因子1(human insulin like growth factor 1,hIGF-1)基因。将hIGF-1基因酶切后插入到pGEX-1λT载体中,连接转化大肠杆菌NM522,筛选克隆,酶切鉴定后测序,并进行了表达。将IPTG诱导表达的菌体离心收集,取少量菌体进行SDS-PAGE分析,在分子量34KD处可见明显高表达带(对照菌没有表达),Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。在完成以上研究的基础上,鉴于原核分泌型表达技术的优势,我们根据原核细胞分泌表达机制及需要,重新设计引物,利用PCR法分别分离出碱磷酸酶启动子(phoA),STII信号肽及hIGF-1编码基因,将它们连接到pUC载体,测序后,通过点突变技术对全基因序列进行了校正。分别构建出两套分泌型表达载体,并将其命名为pCSA和pCST,随后将上述基因装入到pCSA和pCST中,转化大肠杆菌W3110,得到工程菌pCSA/IGF-1/W3110,pCST/IGF-1/W3110,并进行了表达。经SDS-PAGE检测,在分子量7.6KD处有明显高表达带,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。根据中国生物制品检定规程的有关要求,我们进行了基因工程大肠杆菌工程菌的筛选和鉴定,得到工程菌株pCSA/IGF-1/W3110 ,pCST/IGF-1/W3110,经传代培养,提质粒酶切鉴定及蛋白表达测定表明,经100次传代后质粒不丢失,酶切鉴定表明为阳性克隆,蛋白表达稳定。根据中试工艺的要求,我们初步建立了分泌型hIGF-1的生产工艺,即为;种子液制备→发酵培养→离心收集菌体深度冷冻→rhIGF-1低渗震荡溶出→层析前处理→疏水层析→分子筛→离子交换→半成品。参照有关文献,以NIH3T3作为靶细胞,用XTT掺入法,初步建立了hIGF-1生物活性检定方法。