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母鸡的产蛋性能是家禽生产中的一个重要指标,与母鸡卵巢的发育密切相关。卵巢发育是一个动态的、受多种因子调控的复杂过程,但其中具体的因素及其作用机制仍不清楚。在哺乳动物中FOXL2(Forkhead box L2,叉头蛋白L2)一直被认为是控制雌性正常生殖生理的关键因子,同时也被认为是卵巢发育过程中重要的基因,若其发生突变将会造成卵巢早衰等不孕症甚至癌症。本研究以FOXL2为研究对象,通过分别在鸡卵巢poGC(Pre-ovulatory follicle granulosa cells,排卵前卵泡颗粒细胞或称等级卵泡颗粒细胞)和phGC(Pre-hierarchical follicle granulosa cells,等级前卵泡颗粒细胞或称小黄卵泡颗粒细胞)中敲低FOXL2基因的表达,结合转录组测序获取转录基因的变化情况,研究FOXL2在鸡卵泡选择与卵泡发育过程中参与的生物学过程与调控作用。主要的研究结果如下:1.设计并合成三条特异性靶向FOXL2基因的siRNA,利用脂质体在原代培养的鸡卵巢排卵前卵泡颗粒细胞中分别转染不同的siRNA或NC-siRNA,24h后检测FOXL2基因在mRNA水平的敲低效率,发现三条siRNA均有显著敲低效果,敲低效率在55-80%之间,选择出敲低效率最高的一条命名为FOXL2-siRNA用于后续的敲低实验。2.在原代培养的poGC和phGC两组细胞中分别转染FOXL2-siRNA(敲低组)和NC-siRNA(对照组),使用qPCR检测在转染不同时间(24h、36h以及48h)FOXL2基因mRNA的相对表达量。结果显示,在poGC和phGC的实验组中FOXL2基因在mRNA水平的相对表达量均极其显著降低。3.在原代培养的poGC中分别转染FOXL2-siRNA(敲低组)和NC-siRNA(对照组),使用Westrn Blot检测在转染不同时间(24h、36h以及48h)FOXL2蛋白的相对表达量。结果显示,在实验组中FOXL2在蛋白水平的相对表达量在转染24h和36h时影响不显著,直到转染48h后才显著降低(P<0.05)。结合以上结果(2)说明,在FOXL2-siRNA转染48h后,FOXL2基因在mRNA和蛋白水平才均显著下降。4.在原代培养的poGC和phGC两组细胞中分别转染FOXL2-siRNA(敲低组)和NC-siRNA(对照组),收集转染48h后的四组细胞作为待测序检测样品(分别命名为poGC-KD、poGC-CT、phGC-KD和phGC-CT),提取总RNA和蛋白,分别使用qPCR和Westrn Blot检测FOXL2基因在mRNA和蛋白水平的相对表达量。结果显示,在poGC和phGC的敲低组中FOXL2基因在mRNA和蛋白水平均显著下降。选择该批次样品(每组4个重复,共16个样品)进行检测质量合格并通过建库和转录组测序。5.对转录组测序结果,先注释各组表达的基因并计算其表达量;然后将样品按如下分组进行对比:poGC-CT vs.poGC-KD(命名为Comp.po),phGC-CT vs.phGC-KD(命名为Comp.ph),分别获取敲低FOXL2在poGC和phGC中的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)。结果发现在Comp.po组中有1309个DEGs,其中611个上调基因,698下调基因;在Comp.ph组中有775个DEGs,其中368个上调基因,407下调基因。6.GO注释分析发现,Comp.po中的DEGs主要作用于细胞核内,与调节细胞分裂、增殖以及周期进程中染色体的变化过程密切相关;Comp.ph中的DEGs主要参与细胞内信号通路以及免疫相关的过程。7.KEGG通路富集分析发现,Comp.po中的DEGs主要富集在DNA复制、ECM-受体互作、p53信号通路以及细胞周期等通路中;Comp.ph中的DEGs主要富集在ECM-受体互作、细胞因子-细胞因子受体间互作一季粘着斑等通路。结合以上转录组测序的分析结果(6)揭示FOXL2在poGC和phGC具有不同的作用,在poGC中影响细胞增殖、周期和DNA复制等细胞生物学过程。8.使用CCK-8、EdU、流式细胞仪检测在颗粒细胞中敲低FOXL2对细胞增殖、DNA复制、细胞凋亡和周期的影响。结果发现:在poGC中,敲低FOXL2基因可以促进细胞增殖、促进DNA复制、抑制细胞凋亡并促进细胞周期的进程;在phGC中对这些生物学过程的特征没有显著影响。