论文部分内容阅读
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种气道慢性炎症性疾病,以不完全可逆、进行性加重的气流受限和炎症为特征。目前认为COPD将是全球第三大死因,但其发病机制尚未有明确的报道。研究表明,香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)是诱导COPD发生的主要原因。目前研究发现可能的机制主要是:CS中的有害颗粒导致炎性细胞的浸润和聚集,使肺部对其产生异常免疫反应;CS可以激活气道上皮细胞免疫反应;减弱纤毛的运动能力;降低粘液的修复作用;CS能够持续激活肺泡巨噬细胞,从而进一步加重气道炎症反应。COPD急性加重性发作(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)是导致COPD高致残率和高致死率的主要原因。研究表明,不可分型流感嗜血杆菌(Non-typeable Haemophilus influenzae NTHi)是诱发AECOPD的最主要原因,但其机制尚未得到完全阐释。随着对NTHi与调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)相关性研究的不断深入,现已证实NTHi感染导致AECOPD与Tregs介导的适应性免疫应答密切相关,但机制尚需进一步研究。因此,以Tregs为研究对象,阐释NTHi感染诱导的AECOPD的免疫学机制,对解释COPD及AECOPD的发生机制有重要的意义。本研究首先采用被动烟雾刺激的方法对BALB/c小鼠进行全身暴露,建立COPD模型,实验动物分为正常对照组(正常饲养17周,以下称NC组),烟雾组(烟熏17周,以下称CS组),NTHi组(正常饲养16周后,气管滴注NTHi 1周,以下称NTHi组),NTHi-CS混合组(烟熏16周后,气管滴注NTHi继续CS刺激1周,以下称NTHi+CS组)。细菌感染浓度为1×107CFU/ml,感染剂量为30μl,CS组以PBS进行相同处理。造模结束后,肺功能仪(BUXCO,PFT Controller)检测小鼠肺功能。各组小鼠肺功能结束后,取小鼠肺组织,经固定后进行HE染色,观察病理损伤;取小鼠外周血血清,以酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测血清中TGF-β1和IL-17的含量;收集脾脏,制备脾细胞悬液,以流式细胞术(Flow cytometry FCM)检测脾脏中Tregs的变化;小鼠肺组织,经固定后以免疫组化法检测Foxp3、RORγt和IL-17蛋白的表达,并以Real-time PCR法对Foxp3和RORγt m RNA进行检测。肺功能检测结果显示:CS全身暴露法对小鼠建立COPD模型成功,与NC组相比,其他各实验组(CS组,NTHi组和NTHi+CS组)第0.1秒呼出的气体(Forced Expiratory Volume in 100ms,FEV 0.1)均有所降低,其中CS组和NTHi+CS组显著降低(p<0.001,p<0.001);实验组肺功能残气量(Functional Residual Capacity,FRC)均显著增加,其中CS组和NTHi+CS组增加更为显著(p<0.001,p<0.001),CS组和NTHi+CS组肺阻力(RI)显著增加(p<0.001,p<0.001)。HE结果显示:与NC组相比,实验组肺组织出现不同程度的病理改变,CS组和NTHi组出现炎性细胞浸润,肺组织各级支气管上皮细胞轻度缺失、脱落等现象;NTHi+CS组中大量出现炎性细胞浸润,肺组织各级支气管上皮细胞严重缺失、脱落,肺泡腔扩大、融合成肺大泡等现象。FCM结果显示:与NC组比,CS组、NTHi组和NTHi+CS组脾细胞悬液CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例明显降低(p<0.001),但细胞数量在NTHi+CS组相对是增加的,细胞总数(Total cells,Tc)与NC组比较无显著性差异(p>0.05)。ELISA结果显示:与NC组比较,CS组和NTHi+CS组中TGF-β1、IL-17表达均显著升高(p<0.05,p<0.01);NTHi组中IL-17表达显著升高(p<0.001);TGF-β1表达未见显著升高(p>0.05)。免疫组化和Real-time PCR结果显示:与NC组相比,CS组和NTHi组中Foxp3在蛋白水平和m RNA水平表达无明显差异(p>0.05),在NTHi+CS组中表达显著降低(p<0.05),RORγt和IL-17在各实验组中表达均显著增加(p<0.001)。综上所述,通过以上研究可初步认为:CS可以引起COPD的发生,COPD的炎症反应与CS激活Tregs并分泌TGF-β1密切相关;NTHi感染稳定期COPD后,可以通过下调Foxp3,上调RORγt,导致AECOPD。