目的:双歧杆菌的完整肽聚糖(Whole Peptidoglycan,WPG)是双歧杆菌发挥抗肿瘤、抗感染以及免疫赋活等多种生理功能的主要成分,它能激活机体免疫系统中的巨噬细胞,使其分泌多量的细胞毒性效应分子。目前对WPG激活巨噬细胞机制的认识还很肤浅。我们通过观察双歧双歧杆菌的WPG对大鼠腹腔巨噬细胞PKC→NF-κB通路、PKC→ERK1/2→AP-1通路及其对细胞因子TNF-α mRNA表达的影响,探讨双歧杆菌的WPG激活巨噬细胞的信号机制。 方法:分离培养SD大鼠腹腔巨噬细胞,实验分为对照组、WPG刺激组和预孵组。(1)采用激光共聚焦显微镜技术观察巨噬细胞内NF-κB的核移位情况;(2)运用凝胶电泳迁移率检测技术(electrophoretic mobility shfit assay,EMSA)分析巨噬细胞NF-κB和AP-1的DNA结合活性的变化;(3)运用免疫蛋白质印迹(western blot)测定巨噬细胞磷酸化ERK1/2和IκBα的蛋白表达水平;(4)采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测巨噬细胞TNF-α mRNA的表达水平。 结果:(1)正常大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB位于胞浆内;WPG刺激巨噬细胞后,NF-κB被明显激活,移位进入胞核,应用EMSA检测到巨噬细胞NF-κB的DNA结合活性显著高于对照组(P<0.01);应用激光共聚焦扫描显微镜观察到WPG刺激组巨噬细胞胞核NF-κB的阳性率明显高于对照组(P<0.01);同时Western blot检测到胞质中IκBα的蛋白表达显著低于对照组(P<0.01);但经PKC抑制剂Chelerythrine预孵巨噬细胞后,其NF-κB的移位和DNA结合活性及IκBα的降解较WPG刺激组明显减少(P<0.01)。(2)未受WPG刺激的正常大鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2处于低活性状态,给予WPG刺激巨噬细胞,其磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01),但经PKC抑制剂Chelerythrine预孵巨噬细胞后,其磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平明显低于WPG刺激组(P<0.01)。(3)正常大鼠腹腔巨噬细胞AP-1位于胞浆内;WPG刺激巨噬细胞后,AP-1被明显激活,应用EMSA检测到巨噬细胞AP-1的DNA结合活性较对照组显著增高(P<0.01);经ERK抑制剂PD98059预孵巨噬细胞后,其AP-1的DNA结合活性较WPG刺激组显著降低(P<0.01)。(4)TNF-α mRNA在正常静息大鼠腹腔巨噬细胞内有低水平表达,WPG刺激组巨噬细胞TNF-α mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01);但经ERK抑制剂PD98059和NF-κB抑制剂NAC分别预孵巨噬细胞后,其TNF-α mRNA的转录水平均明显低于WPG