目的通过研究重型再生障碍性贫血(Severe Aplastic Anemia, SAA)患者CD8+HLA-DR+效应T细胞功能因子表达水平、对骨髓造血细胞的损伤及其作用的靶细胞,证实CD8+HLA-DR+效应T细胞与SAA患者骨髓衰竭之间的“因果效应”及“因果方式”,进一步阐明SAA免疫损伤骨髓造血的机制；同时采用差异蛋白质组学技术,对SAA患者与正常人髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells,mDC)的蛋白质成份进行分析,筛选激活SAA免疫反应可能的抗原物质,即导致SAA发病可能的自身抗原,为开发靶向治疗药物提供依据。方法研究对象为天津医科大学总医院自2010年4月至2012年4月初治SAA患者、治疗后缓解的SAA患者及正常对照者。第一部分研究效应T细胞损伤骨髓造血细胞的途径,采用免疫磁珠分选24例SAA初治患者及23名健康正常人外周血CD8+HLA-DR+效应T细胞,半定量RT-PCR检测分选细胞效应因子穿孔素、颗粒酶B、肿瘤坏死因子-p(tumor necrosis factor beta, TNF-β)、FasL mRNA表达情况。第二部分验证SAA患者效应T细胞对骨髓造血细胞的损伤作用,以免疫磁珠阳性分选12例SAA初治患者、12例SAA缓解患者及12名正常健康人CD8+HLA-DR+T细胞作为效应细胞,阴性分选去除SAA缓解患者、正常健康人骨髓单个核细胞中CD3+T细胞后作为靶细胞,将SAA初治患者效应细胞分别与SAA缓解患者及正常健康人靶细胞混合培养(分别为实验组1、实验组2),同时设SAA缓解患者效应T细胞与SAA缓解患者骨髓靶细胞混合培养组及正常健康人效应T细胞与正常健康人靶细胞混合培养组作为对照(分别为对照组1、对照组2),72h后通过流式细胞术以膜联蛋白V(Annexin V)检测靶细胞凋亡状况,全自动生化分析仪检测培养体系上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。第三部分明确SAA患者靶向损伤的骨髓造血细胞,分别将SAA患者、正常人CD8+HLA-DR+效应T细胞与正常人的CD3-细胞(免疫磁珠分选获得)混合培养,72h后采用流式细胞术检测培养系中CD14+、CD33+、CD34+,GlycoA+细胞凋亡状况；以单克隆抗体标记SAA患者和正常人骨髓CD34+、GlycoA+、CD33+、CD14+细胞,比较其Fas蛋白的表达量。第四部分探索导致SAA免疫激活的抗原物质,采用贴壁培养法将SAA患者、缓解患者及正常人单核细胞,体外诱导、分化为成熟的mDC,流式细胞仪分选得到高纯度mDC,提取总蛋白,进行双向电泳分离蛋白质,取差异蛋白质点进行比对,明确SAA患者mDC内与正常人不同的蛋白质成分,即为激活mDC,引起SAA一系列自身免疫反应可能的抗原物质。结果第一部分SAA初治组CD8+HLA-DR+效应T细胞穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达量分别为(0.66±0.25)、(0.56±0.26),正常对照组表达量为(0.53±0.14)、(0.40±0.13),前者明显高于后者(P值分别为0.042、0.012)；SAA初治组CD8+HLA-D时效应T细胞FasL nRNA的表达量为(0.77±0.24),明显高于正常对照组(0.61±0.16)(P=0.011)；SAA初治组CD8+HLA-DR+效应T细胞TNF-β mRNA的表达量为(0.58±0.16),亦明显高于正常对照组(0.46±0.15)(P=0.011)。第二部分SAA初治患者效应细胞与SAA缓解患者靶细胞混合培养组(实验组1)、SAA初治患者效应细胞与正常健康人靶细胞混合培养组(实验组2)靶细胞凋亡比例分别为(41.12±24.84)%、(45.81±20.47)%,SAA缓解患者效应细胞与SAA缓解靶细胞混合培养组(缓解组)、正常人效应细胞与正常人靶细胞混合培养组(正常组)靶细胞凋亡比例分别为(35.03±22.09)%、(20.95±13.82)%,实验组1、实验组2、缓解组三组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05),实验组1、实验组2、缓解组均明显高于正常组(P<0.05)；实验组1、实验组2培养体系上清液LDH水平分别为(74.56±49.13)U/L、(62.61±31.76)U/L,明显高于正常组的LDH水平(28.60±8.91)U/L(P<0.05),与缓解组LDH水平(61.06±28.41)U/L比较差异无统计学意义(P>0.05),缓解组LDH水平明显高于正常组(P<0.05)。第三部分SAA组骨髓CD34+细胞Fas蛋白的表达量为46.59±27.60%,明显高于对照组(8.89±7.28%,P<0.01)；SAA组CD14+、CD33+、GlycoA+细胞Fas蛋白的表达量分别为29.29±9.23%、46.88±14.30%、15.15±9.26%,明显低于对照组(51.25±38.36%、72.06±39.88%、50.38±39.88%,P<0.05)。SAA初治患者效应细胞与正常健康人靶细胞(实验组)CD34+、CD33+、CD14+细胞凋亡率分别为55.43±20.50%、38.13±20.10%、61.87±21.65%,均明显高于正常人效应细胞与正常人靶细胞混合培养组(对照组)35.02±13.95%、23.44±10.33%、37.04±22.41%(P均<0.05)；实验组CD45-细胞凋亡率为26.43±24.99%,与对照组22.76±7.62%无明显差异(P>0.05)。第四部分SAA患者mDC细胞内蛋白成分与缓解后患者及正常人之间进行对比,其凋亡相关蛋白(p53、caspase3、Fas),核糖体连接蛋白、泛素化相关蛋白表达增高,与SAA免疫发病机制中mDC细胞激活相关。结论(1)SAA患者外周血CD8+HLA-DR+效应T细胞穿孔素、颗粒酶表达水平均较正常人明显升高,提示穿孔素、颗粒酶可能在SAA患者细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)损伤骨髓造血过程起到了重要的作用；SAA患者CD8+HLA-DR+T效应细胞FasL表达亦明显增高,可能参与了骨髓造血靶细胞的凋亡损伤,同时高表达的FasL也可能参与了辅助性T细胞(helper T cell,Th)亚群的调节,但对CTL本身可能没有作用；此外,TNF-β也是参与CTL损伤骨髓造血靶细胞的重要效应因子,在SAA患者CD8+HLA-DR+效应T细胞的表达也增高。因此,上述三种途径可能均在SAA免疫发病过程中发挥了重要作用。(2)SAA初治患者CD8+HLA-DR+效应T细胞能够明显增加缓解患者及正常人骨髓造血靶细胞凋亡率,提示CD8+HLA-DR+效应T细胞在SAA骨髓免疫损伤中机制中居于重要地位。而缓解SAA患者CD8+HLA-DR+效应T细胞功能并未降至正常,临床应用免疫抑制治疗中应注重足量、足疗程给药,以便彻底控制患者异常免疫状态,防止复发。(3)SAA初治患者CD8+HLA-DR+效应T细胞能够诱导正常人CD34+、CD33+、CD14+细胞凋亡增加,对正常的骨髓造血干/祖、粒系、单核系细胞均具有杀伤作用；经检测SAA患者骨髓CD34+、CD33+、CD14+、GlycoA+细胞均表达Fas抗原,并可能因此被高表达FasL的CD8+HLA-DR+效应T细胞识别,故Fas/FasL系统介导的细胞凋亡在SAA免疫发病中发挥了重要作用；而SAA患者CD34+细胞Fas表达明显增加,可能是SAA免疫损伤的主要靶细胞。(4)SAA患者mDC中凋亡相关蛋白、核糖体连接及泛素化相关蛋白表达异常,可能与mDC的激活相关。