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猪流感(Swine Influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)引起的一种急性、高度接触传播的猪呼吸道传染病,可引起病猪出现体温增高、食欲不振、呼吸困难、咳嗽、流产、延迟出栏等症状,严重危害着世界养猪业。猪的呼吸道上皮细胞同时具有禽流感病毒和人流感病毒的受体,被认为是流感病毒由“禽-人”传播的重要中间宿主和新流行毒株产生的“孵育器”,而2009年甲型H1N1流感的大流行进一步证实了SIV的重要公共卫生学意义。目前防控猪流感最有效的方法是免疫接种,但现有疫苗存在抗原变异频繁、交叉保护力不强的问题。本研究通过反向遗传技术获得鸡胚繁殖力较强的重组H3N2病毒,制备灭活疫苗并在小鼠上评价其免疫原性和保护效力。此外,还将重组H3N2灭活疫苗与M2e分支肽疫苗共同免疫小鼠,发现M2e分支肽显著增强了重组灭活疫苗的交叉保护能力,研究主要从以下方面开展:本研究根据A型流感病毒基质蛋白(matrix protein, M)基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,利用实时荧光定量RT-PCR技术建立A型流感病毒的快速检测方法。该方法敏感性、特异性和重复性良好,对40份实验感染样品的检测结果表明,与常规RT-PCR检测方法相比,该方法灵敏度更高,特异性更强。此方法可应用于流感病毒的监测和致病机理的研究。流感病毒M2蛋白N端的23个氨基酸(M2e)非常保守,是研究具有广谱交叉保护能力的“通用疫苗”的理想靶标。本研究将4个拷贝的M2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得M2e分支肽(M2e-MAP),添加弗氏佐剂免疫小鼠,结果显示:其能诱导高水平的M2e特异性IgG抗体,能有效限制PR8(H1N1)、SwGD96(H1N1)和SwHLJ1(H3N2)病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化,针对致死剂量的PR8(H1N1)病毒的攻击,M2e-MAP+Freund疫苗免疫能显著缓解小鼠食欲减退、发热、颤栗等临床症状,并提供有效的免疫保护(保护率达100%)。上述结果给未来通用疫苗的研究提供了一定参考。H3N2亚型SIV在世界猪群中广泛流行,本研究利用反向遗传技术获得了鸡胚繁殖力较强的重组H3N2(rgH3N2)病毒,其HA和NA基因来源于H3N2病毒,其它六个内部基因来源PR8毒株,制备灭活疫苗并在小鼠上评价其免疫原性和保护效力。此外,本研究还将重组灭活疫苗与M2e分支肽共同免疫小鼠。结果显示:重组H3N2灭活疫苗免疫可刺激小鼠产生高滴度的HI抗体和中和抗体,并能有效限制病毒在肺脏内的复制,对H3N2病毒的攻击能够提供100%的保护,但其对异源病毒的交叉保护力较差;而添加M2e分支肽共同免疫能够诱导小鼠产生高水平的HI抗体、中和抗体(与重组灭活疫苗单独免疫水平相当)及rgH3N2和M2e分支肽特异性的IgG抗体;M2e分支肽的添加显著增强了重组灭活疫苗对异源病毒的免疫保护作用,能有效限制SwGD96(H1N1)和PR8(H1N1)病毒在肺脏内的复制并减轻肺脏的病理变化,对PR8(H1N1)病毒的致死性攻击可提供有效的免疫保护(保护率达100%)。鉴于以上结果,我们认为将M2e分支肽加入灭活疫苗共同免疫可以作为未来流感疫苗研发的参考思路。