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目的：研究Optineurin（OPTN）及其两种疾病相关突变体在细胞内蛋白质量控制的不同，从细胞分子生物学水平揭示其引起不同疾病的可能机制。 方法：为了明确OPTN及其突变体在细胞内的降解代谢：在HEK293细胞内分别过表达三种OPTN蛋白，加入125μg/ml的环己酰亚胺（cycloheximide，CHX），不同时间点收集细胞进行裂解，Western blot检测三种蛋白的蛋白水平，确定三种OPTN是否降解及其速率；加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132或者自噬抑制剂Bafi，收集细胞进行裂解，Western blot检测三种蛋白的蛋白水平，明确其降解通路；加入CHX和MG132或CHX和Bafi，不同时间点收集细胞进行裂解，Western blot检测三种蛋白的蛋白水平，进一步确认其降解途径。筛选并明确介导 OPTN降解的介质：HEK293细胞中分别共表达 GFP-WT-OPTN和 FLAG或 FLAG-Hrd1或myc-trim5或FLAG-RNF6或FLAG-trim8或FLAG-trim26，收集细胞进行裂解，检测WT-OPTN的蛋白水平；在 HEK293细胞中分别共表达 GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN或GFP-E478G-OPTN和FLAG-Hrd1，收集细胞裂解，检测三种OPTN蛋白水平的变化；在HEK293细胞中敲除E3链接酶Hrd148 h，再过表达GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN，加入或者不加入MG132处理，收集细胞裂解，并检测这两种蛋白水平的变化；PCR方法亚克隆突变E3链接酶Hrd1的功能位点ring finger，HEK293细胞中分别共表达三种OPTN蛋白和FLAG或FLAG-Hrd1或FLAG-Hrd1△ring finger，免疫荧光检测其共定位情况；HEK293细胞中分别共表达 GFP-N3和 FLAG-Hrd1或者 GFP-WT-OPTN和 FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG，免疫共沉淀检测GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1的结合情况。探讨E3链接酶Hrd1促进三种OPTN形成聚集的机制：HEK293细胞中分别共表达FLAG-Hrd1和三种蛋白，γ-tubulin的标记微管组织中心，免疫荧光确定聚集和微管组织中心的关系；HEK293细胞共表达GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1，分别加入MG132、MG132和微管解聚药Nocodazole、MG132和HDAC抑制剂TSA或者MG132和dynein抑制剂EHNA进行处理，α-tubulin标记微管结构，免疫荧光检测聚集形态与微管改变的关系；小RNA干扰技术敲除HEK293细胞中的Hrd1，48 h后过表达GFP-WT-OPTN，加入或者不加入MG132进行处理，γ-tubulin标记微管组织中心，免疫荧光观察颗粒分布与微管组织中心的关系。 结果：HEK293细胞分别过表达三种蛋白，加入CHX后收集的蛋白水平提示，GFP-E50K-OPTN降解速率最快，其次为GFP-WT-OPTN，GFP-WE478G-OPTN稳定而不易降解；加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132或者自噬抑制剂Bafi，收集细胞蛋白检测显示，GFP-WT-OPTN和GFP-E50K-OPTN主要经过泛素蛋白酶体系统降解，GFP-E478G-OPTN稳定而不易降解；MG132可延缓泛素蛋白酶体系统对WT-OPTN和E50K-OPTN的降解。HEK293细胞中分别共表达GFP-WT-OPTN和FLAG或E3链接酶（FLAG-Hrd1或myc-trim5或FLAG-RNF6或FLAG-trim8或FLAG-trim26），结果显示，E3链接酶 Hrd1可介导 GFP-WT-OPTN的降解；在HEK293细胞中分别共表达 GFP-WT-OPTN或 GFP-E50K-OPTN或GFP-E478G-OPTN和 FLAG-Hrd1，蛋白水平的变化表明，E3链接酶 Hrd1介导WT-OPTN和E50K-OPTN的降解；在HEK293细胞中敲除E3链接酶Hrd1后再过表达GFP-WT-OPTN或GFP-E50K-OPTN，并检测这两种蛋白水平的变化，结果表明缺失E3链接酶Hrd1时，WT-OPTN和E50K-OPTN降解抑制，而MG132可放大该效应；HEK293细胞中分别共表达三种OPTN蛋白和FLAG或FLAG-Hrd1或FLAG-Hrd1△ring finger，免疫荧光检测显示，三种蛋白均与FLAG-Hrd1共定位，但是与FLAG-Hrd1△ring finger失去共定位功能；此外E3链接酶Hrd1使得WT-OPTN在核周形成较大聚集结构，E50K-OPTN在核周形成分散的聚集，E478G-OPTN在核周形成较小的聚集结构；HEK293细胞中分别共表达GFP-N3和FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1或者GFP-WT-OPTN和FLAG，免疫共沉淀检测显示GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1结合，并泛素化增强。HEK293细胞中分别共表达FLAG-Hrd1和三种蛋白，免疫荧光发现聚集结构均与微管组织中心共定位；HEK293细胞共表达GFP-WT-OPTN和FLAG-Hrd1，分别加入MG132、MG132和微管解聚药Nocodazole、MG132和HDAC抑制剂TSA或者MG132和dynein抑制剂EHNA进行处理，免疫荧光检测提示Nocodazole、TSA和EHNA导致WT-OPTN无法聚集；小RNA干扰技术敲除HEK293细胞中的E3链接酶Hrd1，48 h后过表达GFP-WT-OPTN，加入或者不加入MG132进行处理，免疫荧光观察到MG132处理后，E3链接酶Hrd1的缺失可导致WT-OPTN无法形成聚集，并失去与微管组织中心的共定位。 结论：WT-OPTN和E50K-OPTN主要通过泛素蛋白酶体系统（UPS）而非自噬途径降解，E3链接酶Hrd1不但介导WT-OPTN和E50K-OPTN的降解，还介导其在MTOC形成聚集体或前聚集体结构；E478G-OPTN不易降解，体内两种降解系统都不容易对其发挥作用，但E3链接酶Hrd1可介导其在MTOC形成较小的聚集体结构。