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DNA链之间的精确识别和独特的高级结构决定了其可以作为优秀的自组装分子。在不影响DNA结构的这些特性的前提下,引入活性功能基,开发新功能,创建一类新型的生物功能分子。基于这一指导思想,本课题以DNA高级结构(B-DNA;G-四股螺旋结构)为模型,以丝氨酸蛋白酶、核糖核酸酶A、天冬氨酸蛋白酶活性中心的三维结构及其催化机制为基本参照模板,将咪唑基以5-咪唑乙烯基-2’-脱氧尿苷(1),5-咪唑乙基-2’-脱氧尿苷(7)的形式、羟基以5’-羟乙基-2’-脱氧尿苷(2)的形式、和羧基以5-羧甲基-2’-脱氧尿苷(10)和5-羧乙基-2’-脱氧尿苷(11)的形式分别引入这些DNA高级结构中,开展了以下三部分工作:1)基于B-DNA模型的羧酸酯水解过程的模拟;2)基于G-四股螺旋结构的具有磷酸酯水解功能的新型人工酶设计;3)基于B-DNA模型的具有肽裂解功能的新型人工酶设计。分别以乙酸对硝基酚酯(PNPA)、2-羟丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)以及BACE1天然底物和短肽为靶进行了相应的酶学活性评价,并研究了其结构与功能关系,初步探讨了其催化机制。 1)基于B-DNA模型的羧酸酯水解过程的模拟 通过在B-DNA分子上进行咪唑基和羟基的组装,共设计合成了14种不同结构的功能化DNA双螺旋结构,通过活性评价,筛选出最有效的组合LK-JC-02[5’-d(CGG CCT1A1 CGC GC)-3’,3’-d(GCC GGAA1A GCG CG)-5’],298 K,在缓冲液(50 mM[HEPES],50 mM MgCl2,pH7.2)中将乙酸对硝基酚酯(PNPA)的水解速率提高123倍,并且表现出一系列类似天然酶的典型特征:符合天然酶Michaelis-Menten动力学行为特征;表现出天然酶的多重催化转化的能力;存在酶系催化过程中两个效应的平衡,二级速率常数k2随pH变化曲线呈钟形。通过咪唑基和羟基在不同位点的组装,研究了其结构与功能关系:催化活性的高低不仅仅与咪唑基的个数有关,还与咪唑基组装的有效性有关;同一条链上的两个咪唑基之间具有较强的协同效应;互补链上的两个咪唑基之间的协同效应较弱;而且催化过程对Mg2+不具有依赖性。这些结果有力地验证了以B-DNA高级结构为模型进行新型人工酶设计的可行性,开发了一类全新的生物大分子模拟体系,为基于生物大分子模型的新型人工酶的设计提供了新的选择,同时也为研究羧酸酯水解过程的机理打下了基础。 2)基于G-四股螺旋结构的具有磷酸酯水解功能的新型人工酶的设计 利用核苷类似物1和7在G4螺旋的序列5’-d(TGG GAG)中引入了咪唑基,以2-羟丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)作为裂解磷酸二酯键的模型底物,在303K,于缓冲液(50mM[HEPES],100mM KCl,pH7.0)中进行活性测定,发现LK-JC-19[5’-d(1GGGAG)]对2-羟丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)具有一定的催化活性。考察了Mg2+,Mn2+,Ca2+对LK-JC-19的协同作用,这些金属离子的加入,均使LK-JC-19的催化活性有所提高,其中Mg2+的协同作用是最好的。303K,在缓冲液体系(50 mM[HEPES],50mM MgCl2,100mM KCl,pH7.0)中,LK-JC-19将2-羟丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)的水解速率提高三个数量级(kcat/kuncat=2590),并且表现出一系列类似天然酶的典型特征:具有天然酶类似的Michaelis-Menten动力学行为;能够以催化量的剂量发挥催化作用;与天然酶的催化系统类似,催化过程中存在两个效应的平衡即催化速率和活性中心与底物亲和性的平衡。就所了解的文献报道的结果,对于以2-羟丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)为靶的催化系统,设计的人工酶LK-JC-19是基于功能基组合策略中催化活性最好的低分子量人工酶,催化效率比同类酶设计中活性最好的人工酶要高1个数量级,达到了某些金属酶催化系统的催化水平。为进一步优化功能基的设计,获得更高效率的新功能分子打下了基础。 3)基于B-DNA高级结构的具有肽裂解功能的新型人工酶设计 利用含羧基功能基的核苷类似物合成了8条含羧基功能基的DNA序列,通过B-DNA获得了多个羧基之间的组合。尝试了BACE1天然底物以及人工合成肽段底物的裂解反应,在现有条件下均未取得预期结果。 在合成含功能基的DNA序列中,改进了5-咪唑乙烯基-2’-脱氧尿苷的合成条件,评价了各个功能基引入DNA高级结构后,对高级结构的稳定性的影响。 总之,以上结果显示,DNA作为一类优秀的自组装分子,是完全可以作为设计和承载功能基的模拟体系的,在其上合理地设计几个催化元素,通过之间的协同作用,是完全可以达到酶发挥催化功能所需的要求的。这一思想的实施为其它生物分子的模拟拓展了一条新的思路,为赋予DNA新功能提供了一种新的选择。