背景及目的：IL-33作为新被发现的白介素1家族成员，能够通过与ST2及IL-1RAcP结合形成的异源二聚体结合，募集Myd88,MAPK，从而诱导细胞因子及趋化因子等的合成，进而调控免疫应答与炎症。小鼠IL-33由266个氨基酸构成，羧基端为白介素1样片段，氨基端包括IL-33的核定位序列以及染色质结合位点。在正常生理条件下，IL-33主要表达在细胞核内，在细胞损伤或坏死后会被动释放至细胞外。近年来有研究证实，活细胞在某些刺激下能够分泌IL-33。IL-33没有传统分泌信号肽，且首先定位至细胞核内，因此IL-33的分泌首先需要有细胞胞核转位至胞浆中,关于IL-33的转位机制目前尚不清楚。本研究期望通过分析IL-33序列，寻找IL-33转位的关键氨基酸。　　IL-33被发现后，多数研究认为其与IL-1β类似，需要被酶剪切活化后才能释放至细胞外发挥细胞因子的作用。近年来有研究发现，在特发性肺纤维化患者肺组织匀浆中,IL-33以全长型式存在，且全长IL-33同样能与ST2受体结合发挥作用；在体外实验中，机械牵拉能够使得心脏成纤维细胞分泌全长IL-33。这些研究都暗示，全长IL-33不仅组成性存在于细胞核内并发挥相关功能，在体内可能也会释放至细胞外发挥作用。目前用于外源性刺激的商品化重组IL-33均只包括羧基端IL-1样片段，使用全长IL-33蛋白作为刺激剂可能可以更全面地反映IL-33的实际作用。因此本实验构建全长IL-33重组质粒，并转化至细菌中，诱导转化菌表达原核重组蛋白。　　实验方法：　　1.通过逆转录PCR从SVEC4-10细胞中获得全长IL-33cDNA片段，在片段后增加流感病毒血凝素(HA)标签，连接至pcDNA3.1+质粒中，再通过突变PCR突变该重组质粒，得到第51位丝氨酸突变为谷氨酸的突变质粒。分别将未突变质粒和突变质粒转染至SVEC4-10细胞后，通过免疫荧光观察带HA标签IL-33在细胞中的定位。　　2.通过PCR从以上质粒中得到全长IL-33片段，在片段前增加肠激酶连接位点后，将其连接至pGEX4T-3原核表达载体中。之后将重组质粒转化至BL21菌种中，通过IPTG诱导表达目的蛋白，经过GST亲和纯化柱纯化。　　结果：　　1.结合已有文献分析出IL-33可能存在的与分泌转位相关氨基酸与其修饰方式。　　2.成功构建pcDNA3.1+-proIL-33-HA，pcDNA3.1+-proIL-33-(S51E)-HA，pGEX4T-3-proIL-33质粒。　　3.未突变质粒转染后表达的带HA标签IL-33主要定位在细胞核内，突变质粒转染后表达的带HA标签突变IL-33不仅在细胞核内有表达，在细胞包浆中也有定位，且转位率显著高于未突变IL-33。　　4.使用IPTG诱导pGEX4T-3-proIL-33转化菌后，通过裂解细菌并使用GST亲和柱纯化后能够得到GST-proIL-33融合蛋白。　　结论：小鼠全长IL-33第51位丝氨酸是IL-33转位的关键位点之一，将51位丝氨酸突变为谷氨酸模拟其磷酸化后能够增强IL-33由细胞核转位至细胞胞浆的能力。成功诱导转化菌并能纯化得到GST-proIL-33融合蛋白。