目前,椰子水是国内外细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)产业化生产的主要原料,尤以东南亚一带的椰子水使用最为常见。前期研究和生产实践经验都表明,椰子水破壳取水后,在环境中微生物的作用下自然发酵后再用于BC合成,所得BC产量显著高于新鲜椰子水。近年来,海南本岛椰子果随着旅游热越来越供不应求,海南的椰子加工产业中所使用的椰子果实原料基本进口自越南及印尼等东南亚国家。本实验室前期研究表明,不同产地、预发酵时间及预发酵环境都会显著影响BC的产量。因此,了解不同气候和地域环境对椰子水预发酵的影响、乃至对BC发酵的影响,并对预发酵过程中的菌相进行解析,深入了解不同自然预发酵椰子水中微生物组成及变化的差异显得十分重要,可为BC产业在生产过程中面临的不稳定、不安全等制约因素提供解决问题的理论基础,以期对海南BC行业的发酵生产水平、对产业的健康可持续发展产生积极而深远的意义。本研究对比了越南工厂环境的预发酵椰子水及海南工厂环境的印尼预发酵椰子水对BC发酵的影响,结合成分分析,对比预发酵液中成分变化可能会对BC产量造成的影响。同时采用高通量测序对比研究了两种环境的菌相组成及变化情况,分析了两地的结果差异及其可能反映的本质规律。同时,利用传统手段对优势菌属进行筛选分离以获得单株菌株,用于单菌预发酵、讨论其对BC合成的影响。主要结果如下:(1)不同处理的预发酵椰子水对BC产量的影响基于越南、印尼的椰子两产地,椰子加工厂、实验室两种预发酵环境,设置了 9组不同处理的预发酵椰子水,试验结果均证明其能促进显著BC合成,但促进效果程度不一。9组处理中,印尼样品IN2的促进效果最佳,其预发酵3d时达到6.02 g/L,是对照组(0d)的7.5倍。YV4、YV5促进效果最差,最高产量不到3g/L,但也是对照组的3.8、3.9倍。HN1、HN2、IN1在4d时BC产量最大,分别为5.12g/L、5.87 g/L、5.44 g/L,是对照组的5.1倍、5.8倍、6.5倍。越南样本YV1、YV2、YV3在3 d、4d 时,BC 产量最大,为 5.65g/L(3d)、5.05g/L(4d)、4.90g/L(4d),分别是对照组的7.3倍、6.6倍、6.4倍。由此可见,椰子水自然预发酵对BC合成具有确定且显著的促进作用,且不同预发酵环境、不同地域气候的椰子产地环境以及预发酵时间等均会影响到其促进合成的程度。(2)预发酵椰子水中菌相的分析在印尼样本IN2中,核心细菌菌群以乳酸杆菌属为主,其次为醋杆菌属,在发酵12 h时,乳酸杆菌含量为32%,而醋杆菌的含量仅有0.03%。在发酵1d后,醋酸杆菌含量快速增加,两者的总占比高达细菌菌群含量的98%。真菌菌群则以假丝酵母属为主,在整个发酵过程中,假丝酵母属占比高达85%以上,是印尼样本发酵中的核心真菌。在越南样本YV1中,在发酵12h时,细菌菌属以乳杆菌属为主,其次为醋杆菌属、乳球菌属,而在发酵1-6 d的过程中,乳杆菌属及醋杆菌属占到优势地位,两者的总含量高达98%。而对于越南真菌菌属,除12h样本中假丝酵母属含量为51%,在其他发酵时间的样本中含量很低,在1-6 d的样本中,98%以上的真菌是一类暂未被鉴定的酵母目。根据β-多样性分析可知,印尼样本IN2与越南样本YV1中的微生物结构存在显著性差异。根据α-多样性分析可知,印尼样本中的真菌菌群更为丰富,而细菌菌群则是越南样本YV1的更为丰富。(3)预发酵椰子水中理化成分分析对9组样品的总酸含量、还原糖含量、可溶性固形含量和pH值进行测定,不同样品间各样品变化趋势基本一致,仅在含量上存在差异。对9组样品中的有机酸含量进行测定,结果显示,5种有机酸均有检出,每组样品中乳酸含量最高,同BC产量呈现显著正相关。其次为D-半乳糖醛酸,乙酸,葡萄糖醛酸,其中D-半乳糖醛酸同BC产量呈现负相关性。(4)单菌预发酵椰子水对BC产量的影响从最高产的预发酵椰子水中以传统的分离纯化法筛菌,对所筛菌株按照形态特征进行分类,并从每一类别中挑选出1-2株进行单菌预发酵椰子水,对比各菌株发酵液对BC合成的促进作用。酵母菌、乳酸菌及醋酸菌预发酵椰子水对于BC的促进效果不同,以酵母菌促进效果最佳,最高可达6 g/L,其次为乳酸菌,最高仅有3 g/L,而醋酸菌促进效果不明显(此时对照组产量NCW为0.6g/L,FCW为5.7g/L)。所有单菌发酵菌株中,Y20与84-3对BC产量的促进作用最佳,分别为6.01g/L、6.3g/L。Y20经鉴定为一株奇异酵母(Saccharomyces paradoxus),是一株在亲缘关系上极其接近酿酒酵母的菌株,84-3则为一株实验室筛自椰子水的野生酿酒酵母。综上可知,预发酵椰子水对BC合成的促进作用,与其预发酵过程中微生物的作用有极大关系,以酵母菌作用最突出,且酿酒酵母的作用比假丝酵母更好。