【摘 要】
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目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制CD 147基因的表达,探讨其对结直肠癌干细胞样细胞HT-29生物学功能产生的影响。方法:1)将人的Oct4基因启动子序列克隆至pEGFP-N1
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目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制CD 147基因的表达,探讨其对结直肠癌干细胞样细胞HT-29生物学功能产生的影响。方法:1)将人的Oct4基因启动子序列克隆至pEGFP-N1载体中,构建Oct4-EGFP重组质粒;2)将重组质粒Oct4-EGFP转染结直肠癌细胞HT-29,随后用G418筛选能够稳定表达的细胞;3)利用流式细胞仪对EGFP+细胞进行分选,并检测其肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)标志物CD44所占的比例;4)利用本实验室前期构建的pYr-mir30-shRNA载体通过脂质体Lipo 2000转染人胚肾细胞(HEK293),得到的重组腺病毒分别命名为Ad-shRNA及Ad-shRN A-control;5)利用荧光定量PCR及western blot两种方法,分别检测经腺病毒感染后EGFP+细胞中CD147 mRNA及蛋白的表达情况;6)MTT法探究肿瘤干细胞样细胞(CSC-like cells)经腺病毒感染后增殖能力以及药物敏感性的变化情况;7)Transwell法研究肿瘤干细胞样细胞经腺病毒感染后侵袭能力的变化情况。结果:1)成功构建Oct4-EGFP重组质粒,并用G418筛选出能够稳定表达该质粒的细胞;2)流式细胞仪分选出EGFP+细胞,其CD44表达量高达99.0%;3)荧光定量PCR以及western blot结果显示,经腺病毒感染后CD147 mRNA与蛋白表达水平显著降低;4)MTT实验结果显示,感染后24、48、72与96小时,Ad-shRNA组细胞增殖能力分别下降至42.4%、43.7%、59.3%与61.1%;药物敏感性研究中,除10 μM紫杉醇组外,Ad-shRNA组细胞对其它化疗药物的敏感性明显增强;5)Transwell实验结果显示,Ad-shRNA组细胞穿过膜的数量(31.5±3.5)与对明对照组(95.5±4.5)相比明显减少(P＜0.01)。结论:本实验成功从结直肠癌细胞HT-29中分离出肿瘤干细胞样细胞,通过抑制CD147表达能够降低其增殖与侵袭能力、增强其对化疗药物的敏感性,为以结直肠癌干细胞为目标的治疗提供了新的方法。
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