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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种以大中型动脉血管壁脂质积累为特征的慢性炎症性病变。脂质代谢的紊乱导致脂质在血管内膜的积累,尤其是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)的积累是动脉粥样硬化病变发展的始动因素。血浆中LDL主要是通过低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)摄入细胞而进行代谢。LDL/LDLR途径是负反馈调节系统,其在维持血浆和细胞内脂质稳态中起重要作用。脂噬是一种新的选择性自噬,其可通过自噬体选择性识别脂质并将其运送到溶酶体降解来调节脂质代谢。脂噬在清除过量脂质,维持细胞稳态和预防AS进展中发挥重要作用。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9,PCSK9)是一个与脂质代谢调节密切相关的基因,其通过介导细胞表面的LDLR的降解来参与脂质代谢。那么,脂噬是否可能通过调节PCSK9的表达影响LDLR的表达,从而调节脂质代谢。因此,本课题旨在探讨Hep G2细胞脂噬对PCSK9-LDLR降解途径的影响,进而为LDL/LDLR负反馈调节机制提供新的理论基础。第一部分:脂质负荷对Hep G2细胞脂噬以及PCSK9、LDLR表达的影响目的:探讨脂质负荷对Hep G2细胞脂噬以及PCSK9、LDLR表达的影响方法:用100μg/ml LDL处理Hep G2细胞24小时后,油红O染色和Dil-LDL观察Hep G2细胞脂质摄取情况;免疫荧光检测细胞膜表面LDLR的表达;Western blot检测LC3、P62、LAMP1、PCSK9、LDLR的蛋白表达;免疫荧光共定位观察LC3与Bodipy、LAMP1与Bodipy、LC3与LAMP1共定位情况。结果:与Control组比较,LDL处理增加Hep G2细胞脂质摄取并减少细胞膜表面LDLR的表达;LC3-II、LAMP1及PCSK9的蛋白表达增加,P62及LDLR的蛋白表达降低;LC3与Bodipy、LAMP1与Bodipy、LC3与LAMP1发生大量共定位现象。小结:LDL处理增加Hep G2细胞脂质摄取,引起LDLR负反馈效应,减少细胞膜表面LDLR的表达;增加LC3-II、LAMP1的蛋白表达,降低P62的蛋白表达,同时增加LC3与Bodipy、LAMP1与Bodipy、LC3与LAMP1的共定位,诱导脂噬的发生;增加PCSK9的蛋白表达,降低LDLR的蛋白表达。第二部分:脂噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)对LDL处理的Hep G2细胞PCSK9、LDLR表达以及脂质蓄积的影响目的:探讨抑制脂噬对LDL处理的Hep G2细胞PCSK9、LDLR表达以及脂质蓄积的影响方法:用脂噬抑制剂CQ对HepG2细胞进行预处理,随后加入100μg/ml LDL处理Hep G2细胞24小时,Western blot检测LC3、P62、PCSK9、LDLR的蛋白表达;Dil-LDL观察Hep G2细胞脂质蓄积情况。结果:与LDL组比较,CQ和LDL处理增加了LC3-II、P62、LDLR的蛋白表达,降低了PCSK9的蛋白表达;恢复了细胞膜上LDLR的表达,从而增加Hep G2细胞脂质蓄积。小结:CQ和LDL处理增加了LC3-II、P62蛋白表达,抑制了脂噬的发生;CQ和LDL处理降低PCSK9的蛋白表达,进而增加LDLR的蛋白表达,增加Hep G2细胞脂质蓄积。结论:LDL负荷诱导脂噬的发生,脂噬通过调节PCSK9的表达影响LDLR负反馈效应,为LDL/LDLR负反馈调节机制提供了新的理论基础。