流感病毒(Influenza virus)属于正黏病毒科流感病毒属成员,可分甲、乙、丙三个型,其基因组由分节段单股负链的RNA组成。流感病毒广泛流行于世界各国,对养殖业造成了巨大经济损失的同时,对人类的健康也构成了潜在的威胁,因此,对流感病毒的研究在公共卫生上也有相当重要的意义。对此,本研究通过鸡胚接种、MDCK细胞培养、血凝及血凝抑制实验和RT-PCR等方法,首次从大熊猫鼻腔分泌物中分离并鉴定了一株既能在鸡胚上稳定传代又能在MDCK细胞上稳定产生细胞病变,即以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的大熊猫HINI亚型流感病毒,命名为A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)。大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)全基因克隆和序列分析本文根据GenBank报道的流感病毒H1N1亚型基因序列,对分离的流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)八个基因片段设计了包括全部基因组的8对引物,通过RT-PCR的方法扩增病毒全基因序列,扩增的PCR产物连接pMD18-T载体,转化DH5a感受态细胞,经质粒PCR鉴定出阳性克隆菌后送上海生工公司测序。测序结果通过GenBank的BLAST比对分析,同时使用MEGA5等生物信息学软件对测序结果进行序列同源性分析,并在此基础上建立了分子进化的系统发育树。测序结果发现,流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)的八个节段全基因组共13595bp,其中3’与5’末端有一段较短的保守序列；通过全基因组序列分析,发现本株流感病毒与2009H1N1流感病毒同源性较高,核苷酸序列同源性高达99%,结果表明,A/Panda/Si chuan/01/2011(H1N1)来源于2009H1N1人流感病毒。大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)反向遗传技术的建立本文在大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011(H1N1)全基因序列测序的基础上,将三个分段扩增的聚合酶基因连接成完整的基因,并根据序列信息设计八对包含全部完整基因的引物,同时引入酶切位点BspQI,通过PCR扩增出八个完整的基因,将PCR产物回收并磷酸化后连接pMD18-T,转化DH5a感受态细胞,挑选阳性菌落抽质粒酶切,回收酶切产物；同时使用BspQI对表达与转录载体PBD进行酶切。将二者电泳回收后使用T4DNA酶进行连接反应,将连接产物转化DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆菌抽质粒酶切鉴定后,送上海生工公司测序并进行序列分析。酶切结果显示,在pBD载体中正确插入八个流感病毒基因片段；测序结果表明本次八质粒共转染系统的构建是成功的。将构建的八质粒共转染系统质粒重组菌扩大培养,进行质粒抽提并进行纯化和浓度的检测；同时在细胞瓶里培养293T细胞和MDCK细胞；将所得到的八个重组质粒通过共转染的方法转染到293T细胞,培养48h后收冻293T细胞培养物,将转染产物接种MDCK细胞扩大培养,待细胞产生明显的细胞病变后收冻细胞培养物。将MDCK细胞培养物的上清接种9日龄SPF鸡胚,72h后取尿囊液进行HA和HI实验,将呈阳性的样品通过电镜负染的方法观察病毒粒子。HA和Hl实验结果表明,转染产物在鸡胚尿囊液里得到增殖,产生了重组的病毒离子,通过电镜观察到流感病毒粒子存在。一系列的实验证明,本次反向遗传操作获得成功,为今后流感病毒的研究乃至这类病毒的研究提供了一个优越的操作平台。M2和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究将M2的C端与HA基因融合构建真核表达重组质粒pM2HA,该质粒可在细胞内转录表达；pM2HA免疫小鼠后,可以检测到M2特异性抗体,HI抗体效价与pCI-HA组差异不显著,而中和抗体稍高于后者但差异不显著;小鼠经致死剂量病毒攻击后,pM2HA组实验小鼠体重轻微下降,攻毒保护率达100%,在遭受中等剂量攻毒后能减轻肺脏病理损害程度；同时对于不同亚型的流感病毒也有一定免疫保护力。M2e与HA的联合应用为新型流感疫苗的研究提供了一条新的思路。