在前人有关锰促进肉鸡心肌细胞MnSOD表达研究的基础上,本研究采用体外原代培养肉仔鸡心肌细胞为研究手段,进一步研究不同锰源对心肌细胞中MnSOD基因表达的调节及其可能机制。为此开展了如下3个实验。实验一不同锰源对体外原代培养肉仔鸡心肌细胞中MnSOD基因表达影响的差异。在本课题前期研究的基础上试验采用5×2的二因子完全随机设计。即5种锰源和2个时间,5种锰源分别为MnCl2和3种络合强度分别为弱(Availa-Mn)、中(MnAAB)、强(Bioplex Mn)的有机锰以及不加锰的0对照,采用0.5 mM的锰添加水平,2个时间为加锰处理12h和48h,共组成10个处理组,每组6个重复。实验结果显示,锰和处理时间对细胞MnSOD mRNA有极显著地互作效益(p<0.0001)。与对照相比,添加锰处理12h对MnSOD mRNA的影响不显著,各锰源间没有统计上的差异,但是培养48h各锰源都极显著地增加了细胞MnSOD mRNA的水平(p<0.0001),各锰源间具有极显著差异。其中MnCl2最高,极显著高于MnAAB(p=0.0049)和AvailaMn(p＜0.0001)且与BioplexMn无显著性差异。BioplexMn高于MnAAB (p=0.0111)和AvailaMn (p＜0.0001), MnAAB也极显著高于AvailaMn (p=0.0002)。锰源和处理时间对MnSODp没有互作效益应(p=0.6421)。锰对细胞MnSODp的具有显著的影响(p=0.0157),且主要体现在12h,在48h各锰源对MnSODp没有显著影响,具有显著的时间效应(p=0.0427)。在12h,添加MnCl2(p=0.0062)和MnAAB (p=0.0028)极显著增加细胞MnSODp, AvailaMn (4.2%)和BioplexMn (4.9%)也有增加的趋势,但未达显著水平。锰源和时间对MnSOD酶活没有互作影响(p=0.5720),时间极显著影响细胞内MnSOD酶活,12h酶活极显著高于48h(50.596 vs 33.160,p<0.0001),MnCl2在12h极显著地增加了MnSOD酶活(p=0.0047),其它锰源也有增加MnSOD酶活的趋势,但未达到显著水平。各锰源对MnSOD酶活的影响没有显著性差异。实验结果证实锰是肉鸡心肌细胞中MnSOD基因表达的可靠刺激因子；锰对MnSOD的诱导具有时间差异性,可在转录(48h)和翻译水平(12h)诱导MnSOD表达；MnSOD mRNA是区分不同锰源间差异的最敏感指标,MnCl2和MnAAB对MnSOD基因表达具有近似的诱导作用。并选用MnCl2和MnAAB作为进一步研究无机锰和有机锰差异性的代表,分别在转录水平(48h)和翻译水平(12h)研究不同锰源对MnSOD基因表达影响。实验二不同锰源对体外原代培养肉仔鸡心肌细胞中MnSOD基因表达转录水平的调节及其途径研究。在前期研究的基础上,设定以不添加抑制剂的3种锰处理不添加锰的0对照、含锰0.5mM的MnCl2和MnAAB)为基础,然后在此基础上分别添加10μMS203580、30μM PD98059、50nM JNKIl和500μM NAC的抑制剂处理。处理时间为48h共15个处理组,每个处理组6个重复。实验结果显示锰可激活p38MAPK、JNK和ERK三种信号传导通路,并受特异性抑制剂及活性氧清除剂NAC的抑制；添加MnCl2 (p=0.0079,3.4倍)和MnAAB (p=0.0009,4.2倍)都极显著地增加了细胞中MnSOD mRNA水平,两种锰源之间有极显著差异(p=0.0071)；使用p38MAPK特异性抑制剂SB203580后,对MnCl2和MnAAB的MnSOD mRNA诱导分别有28.1%和22.7%的抑制效应,配对t检验显示,统计显著(p=0.0267和p=0.0245)；使用ERK1/2抑制剂PD98059对两种锰源诱导的MnSOD mRNA的抑制率仅为1.2%和6.2%,t检验显示没有显著影响;使用JNK抑制剂JNKIl对MnCl2的MnSOD mRNA诱导没有抑制作用,对MnAAB的MnSOD mRNA诱导有20.4%的抑制作用,t检验未达到显著(p=0.2588)；使用活性氧清除剂NAC对MnCl2的MnSOD mRNA诱导没有抑制作用,对MnAAB的MnSOD mRNA诱导有11.4%的抑制作用,t检验未达到显著(p=0.3030)。MnCl2(p=0.0044)和MnAAB (p=0.0006)极显著地增加了细胞中活性氧水平,两锰源间没有显著性差异。使用NAC后显著地降低活性氧水平(p=0.0118和p=0.0442)。实验结果证实,Mn在转录水平对MnSOD表达具有调节作用,两种锰源都极显著地增加了MnSOD mRNA水平；Mn激活的p38MAPK, ERK和JNK信号通路是经过ROS介导的；MnCl2诱导的MnSOD mRNA的表达是在ROS介导下通过p38MAPK信号通路实现的,MnAAB的诱导作用也需要ROS的介导,可能通过p38MAPK和JNK信号通路实现。ERK信号通路没有参与锰诱导的MnSOD表达；ROS可能直接作用于MnSOD基因表达的相关转录因子,诱导MnSOD的表达。实验三不同锰源对体外原代培养肉仔鸡心肌细胞中MnSOD基因表达翻译水平调节及其途径研究。为研究锰诱导的MnSOD基因表达在翻译水平上是否通过由PTK和PKC介导的信号通路及其可能的作用机制,开展如下实验。设定以不添加抑制剂的3种锰处理不添加锰的0对照、含锰0.5mM的MnCl2和MnAAB)为基础,然后在此基础上分别添加50μm genistein、lμm calphostin C和500pm NAC抑制剂处理。处理时间12h,共12个处理组,每个处理6个重复。实验结果显示,锰可激活PTK和PKC介导的信号传导通路,并受特异性抑制剂及活性氧清除剂NAC的抑制；锰作用于培养细胞12h对细胞内活性氧没有显著影响(p=0.4045),与对照组相比,NAC极显著地降低细胞内活性氧水平(6.88 vs 8.42,p=0.0003),两锰源间没有显著性差异。MnCl2 (p=0.0074)和MnAAB (p<0.0001)极显著地增加了细胞中MnSODp水平,两锰源间配对t检验,MnAAB显著高于MnCl2 (p=0.0187); MnCl2 (p<0.0001)和MnAAB (p＜0.0001)极显著地增加MnSOD活性,对两锰源配对t检验,具有显著性差异(p=0.0332) MnCl2强于MnAAB。PTK抑制剂Genistein显著地抑制了MnCl2对MnSODp的诱导作用(p=0.0115),对MnAAB的MnSODp诱导有极显著地抑制作用(p=0.0061)；使用抑制剂后,两锰源间没有显著差异(p=0.0507),但细胞内MnSODp, MnAAB仍高于MnCl2;PKC抑制剂显著地抑制了MnCl2对MnSODp的诱导作用(p=0.0399),对MnAAB的MnSODp诱导有极显著的抑制效应(p<0.0001)。使用抑制剂后,两锰源间没有显著性差异(p=0.0790); NAC显著地抑制了MnCl2 (p=0.0238)对MnSODp的诱导作用,对MnAAB的MnSODp抑制达21.8%,但没有显著性(p=0.1253)。使用抑制剂后两锰源间没有显著性差异(p=0.1253),但细胞内MnSODp, MnAAB仍高于MnCl2。使用PTK抑制剂genistein,对MnCl2 (p=0.3299)和MnAAB(p<0.1875)诱导的MnSOD活性升高有一定的抑制作用,但未达显著性差异。PKC抑制剂calphostin C极显著地抑制了MnCl2(p=0.0031);和MnAAB(p<0.0001)的对MnSOD活性的诱导作用,两锰源对此没有显著性差异。使用活性氧清除剂NAC极显著地抑制了MnCl2 (p=0.0003)和MnAAB (p=0.0039)对MnSOD活性的诱导作用,两锰源间没有显著性差异(p=0.2675)。实验结果证实,锰极显著地增加细胞MnSOD蛋白水平和酶活。MnAAB对MnSOD蛋白的诱导作用强于MnCl2,但对MnSOD酶活的诱导却不及MnCl2;锰激活了PTK和PKC介导的信号通路,ROS介导了这一过程；锰对MnSOD蛋白和酶活的诱导经过了PKC信号通路,可能也经过了PTK介导的信号通路,这一过程需要ROS的参与。本研究证实,在体外原代培养的肉仔鸡心肌细胞中,Mn能够成功地诱导MnSOD基因表达,并在转录水平以及转录后的翻译和/或翻译后水平发挥调节作用；MnSOD mRNA是反应不同锰源间差异的最敏感指标；中等络合强度有机锰(MnAAB)对肉仔心肌细胞MnSOD基因表达的诱导作用强于无机锰(MnCl2);Mn诱导的MnSOD的基因表达,在转录水平经过了p38MAPK介导的信号通路；在翻译水平经过了PKC介导的信号通路,这些过程是在ROS的参与完成的；锰作用下可激活ROS介导的p38MAPK、ERK、JNK和PTK、PKC信号通路。