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为深入了解B.cineraBC-31中ABA生物合成途径及其调控机制，并为进一步构建ABA高产工程菌提供理论依据，本论文根据丝状真菌次级代谢产物生物合成调控机理和倍半萜化合物生物合成途径的一般规律，结合对已公布的B.cinereaB05.10基因组数据的分析，筛选了1个可能与B.cinerea中ABA合成调控相关的氮调节因子AREA的编码基因Area以及5个可能与ABA合成中环化步骤相关的倍半萜环化酶的编码基因，并进一步采用基因敲除技术对本实验室产ABA菌株B.cinereaBC-31中这6个基因进行了研究，考察它们与ABA生物合成可能的关联。论文共分四章。
第一章:B.cinereaTB-3-H8倍半萜环化酶基因及氮调节因子AREA基因预测、克隆和序列分析。
以倍半萜环化酶两个保守的结构域为过滤条件，从已公布的B.cinereaB05.10基因组数据库获得5个可能的倍半萜环化酶基因序列，其基因ID分别为BclG_06357,BclG_10537,BclG_14308,BclG_09560,BClG_16381。AREA的编码基因Area在真菌中很保守，为已获得注释的基因(GenBankNo.AY277723)。通过同源克隆在本实验室ABA产生菌B.cinereaTB-3-H8（该菌株与B.cinereaBC-31均选育自同一出发菌）中获取了这6个基因的序列，分别命名为C1，C2，C3，C4，C5，Area，序列分析发现除其中C2的5’非编码区有一段长度为575bp的反转录转座子插入外，其它5个基因的序列与B.cinereaB05.10中的对应基因序列均仅有单碱基的差异，全部6个基因 的读码框起止位置和长度均与B.cinereaB05.10对应基因序列一致。进一步通过RT-PCR分析了C1-C5在B.cinereaTB-3-H8ABA合成初期的转录表达，结果显示5个环化酶基因均有表达，且都表现出一定的由弱到强的诱导表达模式，与ABA合成在时间上有协同性。故所选择的5个环化酶基因均作为下一步敲除对象。
第二章:CaCl2-PEG介导的B.cinereaBC-31原生质体遗传转化体系的建立。
CaCl2-PEG介导的原生质体转化是B.cinerea最常用的遗传转化体系，原生质体的制备和再生是其关键环节。按文献报道的方法操作无法满足转化所需的原生质体数量和再生率的要求，故主要针对原生质体的制备和再生进行了一系列条件研究和优化。首先改进了菌丝体培养方式，由文献报道的液体培养改进为以覆盖玻璃纸的固体培养基培养，结果证明简便易行，原生质体得率和再生率得到显著提高。进一步对菌丝体菌龄、去壁酶酶解时间和温度、再生培养基渗透压稳定剂种类和浓度、再生培养基pH等进行了研究，获得较优的制备条件为:以覆盖玻璃纸的PDA培养，菌龄72h，酶量0.5％(w/v)，酶解温度26℃-28℃，80rpm振荡酶解1.0h-1.5h;再生培养基条件为:0.5M蔗糖+5mMHEPES+1mM磷酸氢二铵+1.2％Agar，pH5.0。该条件下原生质体平均得率约为2.62×106/100mg菌体，平均再生率达到20％左右，原生质体得率和再生率较改进前有大幅提高，且均已满足遗传转化的要求。继而，测试了拟用于后继转化实验的pBARKS1载体对所制备的原生质的转化率，实验结果表明其空载体转化率平均为3个/μgDNA，与国际同行报道的转化率接近。至此，建立起了适用于本实验室ABA产生菌株B.cinereaBC-31的遗传转化体系，为本论文的后继工作以及本实验室的后继基因功能研究打下基础，也可供其它实验室借鉴和参考。
第三章:B.cinereaBC-31倍半萜环化酶基因及Area基因敲除研究。
对本实验室ABA产生菌B.cinereaBC-31的5个倍半萜环化酶基因和一个氮调节蛋白基因Area进行了基因敲除研究，每个基因均获得来自不同批次的两个以上的敲除突变体，共获得阳性敲除突变体17株。采用HPLC检测突变株ABA产量，其中C2,C3，C4,C5和Area对应的共13个突变株的ABA产量与野生株对照相比，无显著差异(p＞0.05)。而C1的4个突变株中，有两株(△C1-2和△C1-9)与对照无明显差异(p＞0.05);另两株（△C1-5-1和△C1-5-2）检测不到ABA，推测可能因为敲除载体额外的插入造成了ABA合成阻断;但Southern杂交分析表明，这两株合成缺陷株中均仅有一个拷贝的敲除载体的插入;对△C1-5-1进一步做C1基因的回补分析发现，ABA产量未见恢复，故证实△C1-5-1的ABA合成阻断并非由于C1基因的敲除造成。以上结果表明，所敲除的5个倍半萜环化酶基因C1，C2，C3，C4和C5均未直接参与ABA的合成，提示B.cinerea中ABA的环化机制可能不同于经典的成环倍半萜，同时也提示单纯通过敲除ABA前体竞争途径来提高其代谢流进而促进ABA产量提高的策略难以凑效。对△C1-5-1的ABA合成基因簇的转录分析表明，可能是转化过程中造成的基因组的某些变化导致ABA合成基因簇转录激活相关遗传元件的受损进而使得ABA合成阻断，具体原因还需进一步分析。
本实验采用基因组数据挖掘结合基因敲除的方法研究了5个B.cinereaBC-31倍半萜环化酶基因和与1个氮调节因子编码基因Area各自与ABA合成的关系，首次证实这6个基因均与ABA合成无直接关联，表明B.cinerea中ABA的环化步骤可能不遵循已知的倍半萜环化机制，也表明B.cinerea中ABA的生物合成可能不受AREA介导的氮源信号调控;B.cinerea中ABA的生物合成途径是否采用一种全新的倍半萜环化机理催化其成环过程尚需实验确证;本实验获得的两株ABA合成缺陷株，为进一步研究ABA合成机理提供了优良的实验材料。
第四章:Scatter:一种新型的且仅在B.cinerea种中发现的的微型反向重复转座元件。
微型反向重复转座元件(Miniatureinverted-repeattransposableelement，MITE)是一类长度较短的，两端带有反向重复序列的不能自主移动的DNA转座子，在基因组结构和功能中都扮演重要角色。在对B.cinereaTB-3-H8的C1基因的5’非编码区进行分析时发现了两段具MITE特征的序列，进一步对三株B.cienrea（T4，B05.10和TBC-A）的核基因组中这两个序列的同源序列进行了分析，发现该族序列确为MITE，命名为Scatter。完整的Scatter元件平均长度为247bp，包含41bp的末端颠倒重复序列和2bp“TA”靶位重复序列。根据对已知转座子序列数据库和Genbank的搜索结果，Scatter序列不同于任何已知的MITE，表明它是一种新型的MITE;而且，Scatter仅存在于B.cinerea这个种中，表明Scatter为B.cinerea特有，并有可能成为鉴定该种的特异的分子标记。Scatter元件之间在序列长度和排列顺序上都有一定程度的差异，暗示它们的增殖可能不是最近发生的。绝大多数Scatter的插入位置在所检测的三株B.cienrea中都是保守的，而且插入相同位置的Scatter元件之间具有相当高的序列相似性。再加上Scatter在三株菌中有非常相近的拷贝数(22-24拷贝)，表明该转座元件的存在可以追溯到B.cienrea菌株分化之前。两个异于其它的插入事件提示，少部分Scatter元件在菌株分化之后仍然具有转座活性。基于三株菌中仅仅有非常微小的插入差异，认为Scatter可能对B.cinerea种内遗传多样性贡献颇小。大多数元件插入区域可能是相邻编码区的调节区，暗示其可能参与转录调节。有关Scatter的起源还需要更深入的研究。
本章实验首次发现了一种新型的MITE，并命名为Scatter，丰富了对基因组中转座元件的认识;Scatter仅发现于B.cinera这个种，有望成为鉴定该种的特异的分子标记;Scatter是第一个在B.cinerea种中获得详细表征的MITE。