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研究背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病。血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化的重要特征，促进动脉管腔狭窄和血管成形术后再狭窄。连接蛋白43(connexin43, Cx43)参与了动脉粥样硬化的发生发展，其表达和功能的改变被认为与巨噬细胞浸润、血管平滑肌细胞(Vascular Smooth MuscleCell,VSMC)迁移、增殖和新生内膜形成相关。因此，抑制血管平滑肌细胞增殖与Cx43活性对于治疗动脉粥样硬化有积极意义。氧化磷脂(Oxidized Phospholipids, OxPLs)是轻微修饰低密度脂蛋白(Minimally Modified Low-Density Lipoprotein, mmLDL)的活性成分，被认为是动脉粥样硬化损伤中的危险因子。大量证据表明氧化磷脂可增强脂质积聚和氧化，促进血管平滑肌细胞表型改变，加速动脉粥样硬化发展。近期有研究发现POVPC(1-palmitoyl-2-oxovaleroyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine)是在动脉粥样硬化损伤中数量最多的氧化磷脂之一,可促进血管平滑肌细胞增殖和Cx43(Ser279/282)磷酸化。白藜芦醇是一种多酚类化合物，具有心血管保护和抗炎作用，但具体机制尚不完全明了。此外，我们前期研究发现白藜芦醇能够抑制AngII诱导的血管平滑肌细胞增殖。那么白藜芦醇对于氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖与Cx43磷酸化是否有抑制作用？其可能的机制是什么？尚需要进一步研究。目的：1．研究白藜芦醇对于氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖和Cx43磷酸化的抑制作用。2．研究Src/MEK/ERK1/2信号通路是否参与调控白藜芦醇抑制的血管平滑肌细胞增殖和Cx43磷酸化。方法：1．无血清培养基中加入不同浓度白藜芦醇(0-50μM)培养24h，CCK-8细胞活力检测试剂盒检测白藜芦醇的细胞毒性。10%FBS培养基中加入不同浓度POVPC培养24h，CCK-8细胞活力检测试剂盒检测POVPC对细胞增殖的影响。白藜芦醇预处理血管平滑肌细胞30min，加入POVPC在含10%FBS培养基中继续培养24h。应用CCK-8细胞活力检测试剂盒观察不同浓度白藜芦醇对血管平滑肌细胞活力的影响；用EdU细胞增殖检测试剂盒检测白藜芦醇对POVPC诱导的细胞增殖的影响；流式细胞检测观察细胞周期的改变。2．白藜芦醇预处理血管平滑肌细胞30min，加入POVPC继续培养30min，用western blot方法检测磷酸化Cx43水平。3． POVPC干预血管平滑肌细胞不同时间(10min，20min，30min)，用westernblot方法检测磷酸化ERK1/2，MEK和Src水平。白藜芦醇预处理血管平滑肌细胞30min，加入POVPC继续培养30min，用western blot方法检测磷酸化ERK1/2，MEK和Src水平。4． Src特异性抑制剂(PP2)，MEK1特异性抑制剂(PD98059，抑制MEK活性，从而抑制ERK1/2磷酸化)预处理血管平滑肌细胞30min，在POVPC条件下培养24h。用EdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖；流式细胞术观察细胞周期的改变。5． Src特异性抑制剂(PP2)，MEK1特异性抑制剂(PD98059)预处理血管平滑肌细胞，在POVPC条件下培养30min。用western blot方法检测Cx43磷酸化水平。结果：1．白藜芦醇对氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响：应用不同浓度白藜芦醇干预血管平滑肌细胞，0-50μM白藜芦醇对血管平滑肌细胞并不产生毒性作用；POVPC呈剂量依赖性促进血管平滑肌细胞增殖，5μg/ml时促增殖作用最强；白藜芦醇呈剂量依赖性抑制5μg/ml POVPC诱导的血管平滑肌细胞增殖。POVPC刺激24h增加血管平滑肌细胞[3H]胸腺嘧啶结合27.1%，10μM、50μM白藜芦醇干预后分别使[3H]胸腺嘧啶结合降低21.0%、34.0%。EdU细胞增殖检测发现5μg/ml POVPC刺激24h，血管平滑肌细胞增殖率增至48.6%，是空白对照组的1.7倍，50μM白藜芦醇干预可减少POVPC增强的细胞增殖15.9%。空白对照组与白藜芦醇干预组比较无统计学差异。流式细胞检测发现与空白对照组相比，POVPC刺激血管平滑肌细胞24h，G1期细胞减少了27.7%，S期细胞增加26.9%，与POVPC刺激组相比，白藜芦醇干预组G1期细胞减少20.3%， S期细胞增加24.0%。2．白藜芦醇对氧化磷脂诱导的Cx43磷酸化的影响：POVPC (5μg/ml)刺激血管平滑肌细胞30min，Cx43磷酸化水平显著增高，白藜芦醇预处理可明显降低POVPC增强的Cx43磷酸化。3．氧化磷脂对Src、MEK、 ERK1/2磷酸化水平的影响：血管平滑肌细胞在POVPC刺激条件下培养10min,20min和30min。Westernblot检测发现刺激30min使Src、MEK、 ERK1/2磷酸化水平明显升高。4．白藜芦醇对氧化磷脂增强的Src、MEK、 ERK1/2磷酸化水平的影响白藜芦醇显著降低POVPC诱导的Src、MEK、 ERK1/2磷酸化水平。5． Src、MEK、 ERK1/2对氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖和Cx43磷酸化的影响：Src特异性抑制剂(PP2)，MEK1特异性抑制剂(PD98059)预处理血管平滑肌细胞30min，在POVPC条件下继续培养24h。PP2与PD98059干预均明显抑制细胞增殖。流式细胞检测发现PP2与PD98059使细胞停滞在G1期，同时S期细胞数量减少。Src特异性抑制剂(PP2)，MEK1特异性抑制剂(PD98059)预处理血管平滑肌细胞30min，加入POVPC继续培养30min。PP2与PD98059干预均明显抑制Cx43磷酸化。结论：1．白藜芦醇呈浓度依赖性抑制氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖和Cx43磷酸化。2． Src/MEK/ERK1/2信号通路参与调节白藜芦醇对氧化磷脂诱导的血管平滑肌细胞增殖和Cx43磷酸化的抑制作用。