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血竭是龙血树属植物的木质部分泌的一种红色树脂,具有活血化瘀、消炎镇痛和止血生肌等功效。目前人们对血竭的化学成分、药理活性及临床应用的研究较多,但对其形成机制并不了解。海南龙血树是国产血竭的主要基源植物,其血竭中的主要活性物质是类黄酮化合物。二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是海南龙血树类黄酮生物合成途径中的关键酶之一。本研究从海南龙血树中克隆了 1个DFR基因DcDFR1,并对其表达调控特征进行了研究,为揭示海南龙血树类黄酮生物合成途径和血竭形成的机制奠定了基础。DcDFR1含有1005 bp的开放阅读框,编码334个氨基酸残基,分子式为C1673H2619N439 0485 S23,分子量为37.38 kDa,预测的理论等电点为6.10。DcDFR1蛋白具有典型的植物DFR保守的NADPH结合结构域和底物结合结构域,属于非Asn/Asp型 DFR。DcDFR1 蛋白与红掌(Anthurium andraeanum)、美洲黄莲(Nelumbolutea)、法国水仙(Narcissus tazetta)、牡丹(Paeonia suffruticosa)中的DFR蛋白的同源性都在70%以上。进化树分析结果显示DcDFR1与同属单子叶植物的法国水仙以及红掌相似度较高亲缘性较近,与双子叶亲缘性相差较远。通过原核表达获得His-DcDFR1和GST-DcDFR1两种融合蛋白,其中His-DcDFR1融合蛋白主要以包涵体的形式存在,而GST-DcDFR1融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体形式存在。分别对His-DcDFR1融合蛋白和GST-DcDFR1融合蛋白进行纯化,通过HPLC的方法检测融合蛋白活性,发现2种融合蛋白对DHK、DHQ、DHM这三个底物没有显示出活性。DcDFR1在花中的表达量最高,其次是果、叶、根和茎。UV-B、NaCL、6-BA、ABA、JA和蔗糖均能诱导DcDFR1的表达,其中紫外线显著上调DcDFR1的表达。克隆了 1581bp的DcDFR1启动子序列,该区域具有典型真核生物启动子结构特征,含有茉莉酸、乙烯和水杨酸等激素响应元件,以及光、干旱和真菌等胁迫响应元件。此外,启动子区也存在MYB、bHLH、NAC和bZIP等转录因子结合元件。酵母单杂交结果表明转录因子DcTT2、DcMYB1、DcMYB3和DcNAC1能够与DcDFR1启动子结合。亚细胞定位分析发现,这4个转录因子均定位于细胞核。