论文部分内容阅读
植物的自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是为了避免白花受精而进化出的重要遗传机制。甘蓝SI的分子过程是由存在于花粉中的S-位点富含半胱氨酸蛋白(S-locuscystein-richprotein,SCR)亦称为S位点蛋白11(S-locusprotein11,SP11)识别结合柱头上的S受体激酶基因(Sreceptorkinasegene,SRK)启动,将原本结合于SRK上的负调控因子类硫氧还蛋白(Thioredoxin-likeprotein,THL)释放出来,然后通过目前尚未完全知晓的分子过程,实现自交不亲和性。SRK(S位点受体激酶)、SCR/SP11(S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11)和THL1(类硫氧还蛋白)是甘蓝自交不亲和性信号传导过程的重要的三个元件。本研究利用酵母双杂交技术探讨甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的关系。
本研究利用PCR技术获得两种甘蓝SCR2(classⅡ)、eSRg2(classⅡ)、THL1、SRKJ(classⅠ,SRK6激酶域)和eSRKzs(classⅠ)的编码序列,并分别构建以pGBKT7为载体的SCR2、THL1的重组“诱饵”质粒和以pGADT7为载体的eSRK2、eSRK28、SRKJ的重组“猎物”质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK2-SCR2,eSRK28-SCR2,SRKJ-THL1的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用,表明重组表达载体构建成功;试验组合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]在三缺平板(SD/-Trp-Leu-His/x-a-gaFAbA,TDO/x/A)上生长出蓝色克隆,激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3;实验组合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]能够在二缺平板(SD/-Trp-Leu)生长,但在三缺平板培养基上不生长,表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用;实验组Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]能够在四缺平板培养基上生长,激活了4种报告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)。相同的单倍型SRK与SCR之间能够相互作用,不同的单倍型之问不会发生相互作用;酵母中报告基因表达的数目和类型的差异所反映了classⅡ型内部的SCR-SRK和classⅠ的SCR-SRK互作强度,Ⅰ型高于Ⅱ型;THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不亲和性表型所依赖的三个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。主要研究结果总结如下:
1.Ⅰ型和Ⅱ型的SCR2及eSRK2的基因克隆及序列分析
扩增的eSRK2位于第一个外显子的74bp～1321bp之间,编码了416个氨基酸。VectorNTIAdvance分析Ⅰ和Ⅱ型的SRK氨基酸序列,发现classⅡ型的eSRK之间的相似性要高于classⅠ型。ClassⅡ型中的S-2、S-5和S-15之间的序列相似性达到93%～97.3%;classⅠ型的S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之间氨基酸序列相似性比classⅡ型要低一些。比对分析发现Ⅰ和Ⅱ型的氨基酸序列在219～330的氨基酸区间和446～460的氨基酸区间呈现较大的差异,classⅠ型的氨基酸存在部分缺失。
本研究扩增的是SCR2的第二个外显子,共编码65个氨基酸。应用VectorNTIAdvance分析不同的SCR氨基酸序列显示了拟南芥和甘蓝氨基酸序列的趋异。在class-Ⅰ型中不同单倍型SCR氨基酸的相似度为20～76%;class-Ⅱ型中不同单倍型SCR蛋白质序列两两之间的相似度达到63～94%。Class-Ⅰ型SCR的4个半胱氨酸残基高度保守,另外4个半胱氨酸残基所处的位置略有差异;而class-Ⅱ型SCR的8个半胱氨酸残基高度保守。
2.诱饵蛋白毒性及其自激活检测分析和pGADT7-SRK毒性检测分析
pGBKT7-SCR2质粒的菌落出现在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal平板上为白色菌落;pGBKT7-THL1质粒在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal的平板上出现了生长状态良好,菌斑与空载pGBKT7大小相近、菌斑密度均无明显差异,证明转入的表达蛋白对酵母无毒害作用。pGBKT7-SCRzpGBKT7-THL1在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上没有菌落生长。pGBKT7-SCR:和pGBKT7-TH1质粒的酵母细胞中没有激活报告基因AUR1-C和MEL1,没有发生自身的转录激活作用。
pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2在SD/-Leu平板上生长状态良好。而且其对照pGADT7斑点大小及生长时间与pGADT7-eSRK2pGADT7-SRKJ一致,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。
3.SCR2与eSRK2;eSRK28与SCR2;SRKJ与THL1相互作用检测
Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]都能在DDO/x/A平板上长出明显的蓝色菌落,激活了报告基因AUR1-C和MEL1;Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]在DDO/x/A平板上未长出蓝色菌落,初步判断没有相互作用。为更进一步检测相互作用的可能性,排除假阳性和假阴性的出现;而后将DDO/x/A平板上的蓝色克隆划线至TDO/x/A和QDO/x/A平板上,4天后发现涂有Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]的TDO/x/A在平板上呈蓝色,而QDO/x/A平板上酵母菌株没有生长的迹象,由此可表明报告基因HIS3也能被激活,而报告基因ADE未激活。而Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR28]×Y187[pGADT7-eSRK/s]在TDO/x/A和QDO/x/A在平板上都呈蓝色,由此可表明报告基因HIS3和ADE被激活。Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2s]的融合株的融合株在三缺平板和四缺平板上都没有生长,证明了不同单倍型之间没有相互作用。