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ERK (extracellular regulated protein)是存在于哺乳动物细胞中的有丝分裂原活化蛋白激酶,是mTOR信号通路的上游调节因子。ERK/mTOR信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号,进而调节细胞生长和代谢。目前ERK/mTOR信号通路在人和其他模式生物中有了较为深入的研究,但在山羊细胞中的研究尚属空白。内蒙古白绒山羊是经过长期的自然选择和人工选育而形成的地方性品种,对氨基酸的利用与代谢有其特殊性。亮氨酸(Leu)是动物体内唯一的生酮氨基酸,是支链氨基酸中对蛋白质代谢起主要调节作用的氨基酸,可以激活mTORCl,促进p70S6K的磷酸化,进而促进蛋白质合成。本研究旨在探讨内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞中ERK调节细胞生长和感受Leu信号的分子机制,力图实现对ERK/mTOR信号通路介导氨基酸信号调控细胞生长机制的初步认识。实验研究分为两个阶段,首先利用MEK特异性抑制剂U0126处理细胞,抑制ERK1/2活性,观察对细胞生长的影响,证明ERK信号通路对绒山羊胎儿成纤维细胞生长具有调控作用；之后采用抑制剂和Leu组合处理的方法,探讨ERK/mTOR/p70S6K信号通路感受氨基酸刺激的机制。第一阶段分别运用MTT法和细胞计数法绘制抑制率曲线及细胞生长曲线,检测U0126对细胞生长的影响。第二阶段首先检测Leu刺激细胞后,ERK1/2的蛋白表达水平和磷酸化水平,再运用免疫共沉淀技术和酵母双杂交技术检测ERK和p70S6K的相互作用关系。结果表明,U0126对内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞的生长有着明显的抑制作用,IC50为1.52μM。同时,U0126对mTOR的下游效应器p70S6K、S6、4EBP1的磷酸化水平都有明显的抑制作用。用Leu刺激细胞,ERK1/2(T202/Y204)的磷酸化水平有了明显的提高；当使用U0126阻断MEK/ERK通路后,发现Leu仍然可以提高ERK1/2的磷酸化水平。预示着ERK感受Leu信号刺激可能不依赖于MEK/ERK信号通路。为了探讨Leu信号激活ERK1/2的可能机制,我们以ERK1/2抗体为诱饵抗体做免疫共沉淀并进行western blot鉴定,表明ERK1/2和p70S6K可以形成复合物,存在着直接或间接的相互作用关系。进一步的酵母双杂交实验表明ERK2和p70S6K并不存在直接的相互作用,但不能排除ERK1和p70S6K可以发生直接的相互作用或ERK1/2与p70S6K之间存在间接的相互作用关系的可能,需要进一步实验的验证。本文从确定ERK具有调控绒山羊胎儿成纤维细胞生长的作用出发,初步探索了ERK调控细胞生长和感受Leu信号的分子机制,为阐明ERK/mTOR信号通路在介导氨基酸营养信号调控绒山羊细胞生长中的作用与机制提供了科学数据。