第一章 槲皮素对卵巢去势大鼠骨质疏松的影响背景骨质疏松症是一种临床较为常见的代谢性疾病,主要表现为骨量的丢失,骨小梁微结构的破坏。女性在绝经期后,由于体内雌性激素的缺乏,导致免疫系统激活,炎症因子慢性持续增高,成骨与破骨平衡打破。破骨活性高于成骨,最终造成骨质疏松的进一步加重。大量研究已经证实,杜仲叶具有抗骨质疏松的疗效。与其他成分相比,杜仲黄酮类抗绝经后骨质疏松能力最强。已有研究证实槲皮素作为杜仲黄酮类有效成分具有抗骨质疏松的作用。本实验通过研究槲皮素对卵巢去势大鼠骨质疏松的影响,为今后发展中药治疗绝经后骨质疏松症提供有效的临床依据。目的:分析槲皮素治疗去卵巢大鼠骨质疏松的疗效。方法:将30 办SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)10只、模型组(OVX组)10只、槲皮素组(Quercetin+OVX组)10只。Sham组与OVX组给予羧甲基纤维素钠3ml/day,Quercetin+OVX组给予槲皮素50mg/kg.day。每天一次,连续8周。(1)8周后腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠,从股动脉采血,检测血清中钙(S-Ca)、磷(S-P)等浓度水平。(2)从大鼠膀胱抽取尿液,并检测尿液中钙离子(U-Ca)和磷离子(U-P)的浓度水平。(3)采用Micro-CT检测股骨千骺端骨小梁微观结构变化情况。(4)利用SPSS22.0软件对结果进行统计分析。结果:(1)槲皮素可降低卵巢去势大鼠尿液中钙、磷的丢失。(2)尚不能说明槲皮素对卵巢去势大鼠体内的S-Ca,S-p有影响。(3)槲皮素可改善卵巢去势大鼠骨质疏松的骨微结构，增加骨密度,但不能使骨小梁结构完全恢复。结论:(1)槲皮素作为杜仲黄酮类单体对卵巢去势大鼠具有抗骨质疏松的作用。(2)槲皮素可能是通过改善骨代谢,增加BMD,提高骨形态学参数达到抗骨质疏松的作用。第二章 槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导成骨的影响背景:骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是成骨前体细胞的重要来源。近来研究发现:骨髓间充质干细胞凋亡数量增加是导致成骨前体细胞减少的关键因素,也是绝经后骨质疏松症形成的重要原因。有研究表明,槲皮素不仅能够诱导破骨细胞的凋亡、抑制破骨细胞对骨质的吸收,还能够增强成骨细胞分化活性,从根本上缓解骨质疏松的症状。我们第一部分的实验结果也证实:槲皮素可以改善PMOP大鼠的骨微结构,显著增加骨小梁面积比、骨小梁厚度,降低骨小梁数量。本部分的重点是在体外研究槲皮素是否可以提高BMSCs的成骨分化能力,增加成骨细胞的数量,从而提高绝经后骨质疏松骨密度,为后一步槲皮素如何促成骨分化的分子机制研究提供理论基础。目的研究槲皮素是否是通过提高BMSCs的成骨分化能力,增加成骨细胞的数量,从而提高绝经后骨质疏松骨密度的。方法将40只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)10只、模型组(OVX组)30只,8周后对各组的BMSCs进行体外分离培养。(1)对Sham组及OVX组的BMSCs进行传代培养及鉴定BMSCs细胞表面抗原。(2)对OVX组中的BMSCs,分别给予不同浓度槲皮素(5μM、10μM、20μM)处理,用MTT法观察槲皮素对OVX组大鼠中BMSCs增殖的影响。(3)利用茜素红染色法检测不同浓度槲皮素对BMSCs细胞诱导成骨后钙化结节的影响。(4)利用PNPP法检测槲皮素对BMSCs细胞诱导成骨后细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。(5)利用SPSS22.0软件对结果进行统计分析。结果:(1)流式细胞仪鉴定各组BMSCs细胞表面抗原,其中CD29、CD90为阳性,CD45为阴性,符合BMSCs表面标志物特点。(2)槲皮素可增加卵巢去势大鼠BMSCs细胞的增殖,且最佳浓度为10μM。(3)槲皮素可促进BMSCs细胞诱导成骨,促进钙结节形成,且最佳浓度为 10μM。结论:槲皮素可促进BMSCs增殖及成骨细胞分化,其作用的最佳浓度均为10μM。第三章 FoxO1介导槲皮素抗TNF-α诱导的BMSCs凋亡背景:绝经后妇女雌激素表达水平降低,免疫系统的慢性持续激活产生大量的炎症因子,TNF-α是其中最重要的炎症因子,其在诱导成骨前体细胞凋亡过程中发挥着重要的作用。TNF-α不仅能够激活NF-κB信号,还可增加氧自由基(reactive oxygen species,ROS)引起BMSCs的凋亡。除此之外,还能够诱导FoxO1基因(Forkhead box transcription factor O1,FoxO1)表达增加,且FoxO1 基因表达增加能提高BMSCs的抗调亡能力。已有研究表明PI3K(phosphoinositide3-kinase)信号通路是调节细胞凋亡与氧化平衡的关键因素,同时氧化应激反应同样可以激活PI3K,转换不同细胞外的刺激(环境应激和促凋亡因子入核)。除此之外,有证据表明FoxO蛋白家族是PI3K/AKT通路的重要下游靶点,参与细胞凋亡,促进凋亡蛋白的失活、衰减诱导活性氧的增加,但具体这一抗氧化应激的保护机制是如何发挥作用的仍然不明确。目的观察槲皮素抗TNF-α诱导BMSCs细胞凋亡作用,并进一步探讨其作用机制。方法(1)取第四代BMSCs,分为Sham对照组、TNF-α组、槲皮素+TNF-α组、槲皮素+TNF-α+PI3K抑制剂组、槲皮素+TNF-α组+FoxO1抑制剂组,利用MTT法观察各组BMSCs细胞活性。(2)利用流式法检测Sham对照组、TNF-α组、槲皮素+TNF-α组、槲皮素+TNF-α+PI3K抑制剂组、槲皮素+TNF-α组+FoxO1抑制剂组的细胞内凋亡水平。(3)利用流式法检测Sham对照组、TNF-α组、槲皮素+TNF-α组、槲皮素+TNF-α+PI3K抑制剂组、槲皮素+TNF-α组+Fox01抑制剂组的细胞内ROS水平。(4)检测Sham对照组、TNF-α组、槲皮素+TNF-α组、槲皮素+TNF-α+PI3K抑制剂组、槲皮素+TNF-α组+FoxO1抑制剂组的细胞SOD与MDA水平以评估细胞抗氧化水平。(5)利用qPCR法及Western blot法检测各组细胞内PI3K与FoxOl的mRNA转录水平和蛋白表达水平。结果:(1)槲皮素可使大鼠BMSCs细胞的增殖率显著增高,且浓度为10μM时,增殖率最大。(2)与Sham组相比,TNF-α组的细胞内细胞调亡率显著升高,而用槲反素干预后,其细胞凋亡率有所降低。对槲皮素+TNF-α组分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,其细胞凋亡含量显著增高。(3)与Sham对照组相比,TNF-α组的细胞内ROS含量显著升高,说明细胞内TNF-α水平增高使得细胞内ROS含量升高;加入槲皮素干预后,ROS含量显著降低,说明槲皮素能促进细胞内ROS含量的降低;对槲皮素+TNF-α组分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,其ROS含量显著增高。(4)与Sham组相比,TNF-α组内SOD含量显著降低,而用槲皮素干预后,其SOD含量显著升高。对槲皮素+TNF-α组分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,其SOD含量显著降低。(5)与Sham组相比,TNF-α组内MDA含量显著增高,而用槲皮素干预后,其MDA含量显著降低。对槲皮素+TNF-α组分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,其MDA含量显著增高。(6)与Sham组相比,TNF-α组的细胞内Bax、P65的转录与翻译水平显著升高,Bcl-2、FOXO1的转录与翻译水平显著降低;用槲皮素干预后,TNF-α组的细胞内Bcl-2、FOXO1的转录与翻译水平显著升高,Bax、P65的转录与翻译水平显降低,说明槲皮素能升高细胞内Bcl-2、FOXO1的转录与翻译水平,显著降低Bax、P65的转录与翻译水平;对槲皮素+TNF-α组分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,细胞内Bcl-2、FOXO1的转录与翻译水平显著降低,Bax、P65的转录与翻译水平显著升高,即PI3K与FoxO1能促进Bcl-2、FOXO1的转录与翻译水平增加,降低Bax、P65的转录与翻译水平。结论:槲皮素能够抗TNF-α诱导的BMSCs细胞凋亡,槲皮素增强BMSCs抗凋亡能力可能是通过调控PI3K/Akt/FoxO1/NF-kB信号通路并抑制自由氧释放实现的。第四章 FoxO1信号通路在槲皮素促进BMSCs诱导成骨中的作用关系研究背景:绝经后骨质疏松症是一种全身性的骨骼老化或废用退化相关的疾病,其主要特征是骨量减少、骨组织显微结构退化、骨脆性增加[1-3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是成骨前体细胞的重要来源,且BMSCs具有良好的增殖能力和多组织分化潜能,在特定微环境的诱导下可向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等不同细胞系分化[4]。槲皮素属于杜仲黄酮类,是一种有效的酚型抗氧化剂,可通过降低脂质过氧化物水平、增加抗氧化系统的能力,从而对机体提供保护作用。我们本课题在之前部分的研究中也证实了槲皮素是杜仲黄酮抗骨质疏松的主要成分,其骨质疏松模型大鼠接受槲皮素治疗后,骨密度和骨小梁数量显著增高,且通过增加BMSCs抗凋亡能力及向成骨分化的能力,达到治疗骨质疏松症的效果,但是确切的机制还需要进一步研究。目的探讨槲皮素促进BMSCs诱导成骨与FoxO1信号通路之间的关系。方法(1)取第四代BMSCs,分为Sham组、OVX组、OVX+槲皮素组、OVX+槲皮素+PI3K抑制剂组、OVX+槲皮素+Fox01抑制剂组。(2)利用茜素红染色法分析Sham组、OVX组、OVX+槲皮素组、OVX+槲皮素+PI3K抑制剂组、OVX+槲皮素+FoxO1抑制剂组的成骨分化情况。(3)利用PNPP法分析Sham组、OVX组、OVX+槲皮素组、OVX+槲皮素+PI3K抑制剂组、OVX+槲皮素+FoxO1抑制剂组的成骨分化情况。(4)利用qPCR法检测Sham组、OVX组、OVX+槲皮素组、OVX+槲皮素+PI3K抑制剂组、OVX+槲皮素+FoxO1抑制剂组内的FoxO1、P65、Runx2、Osterix的转录水平。(5)利用wb法检测Sham组、OVX组、OVX+槲皮素组、OVX+槲皮素+PI3K抑制剂组、OVX+槲皮素+FoxO1抑制剂组内的FoxO1、P65、Runx2、Osterix的表达。结果:(1)与Sham组相比,OVX组BMSCs细胞内矿化结节数显著减少;与OVX组相比,槲皮素+OVX组内矿化结节数显著增多;与槲皮素+OVX组相比,分别加入PI3K抑制剂与FoxO1抑制剂,其矿化结节数显著减少。(2)与Sham组相比,OVX组BMSCs细胞内ALP水平显著降低,与OVX组相比,槲皮素+OVX组ALP水平显著升高;与槲皮素+OVX组相比,分别加入PI3K抑制剂与FoxO1抑制剂,其ALP水平均显著降低。(3)与OVX组相比,Sham组的细胞内FOXO1、Osterix、Runx2的转录与翻译水平显著升高,P65的转录与翻译水平显著降低,说明骨质疏松模型鼠造模成功;用槲皮素干预后,OVX组的细胞内P65的转录与翻译水平显著降低,FOXO1、Osterix、Runx2的转录与翻译水平显著升高,说明槲皮素能升高细胞内Osterix、Runx2、FOXO1的转录与翻译水平;对槲皮素+OVX诱导成骨组相比,分别加入PI3K与FoxO1抑制剂后,细胞内FOXO1、Osterix、Runx2的转录与翻译水平显著降低,P65的转录与水平显著升高,即PI3K与FoxO1能促进Osterix、Runx2的转录与翻译水平增加,降低P65的转录与翻译水平。结论:槲皮素促进BMSCs诱导成骨可能是通过PI3K/Akt/FoxO1/NF-κB信号通路,调控Runx2/Osterix表达实现的。