磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)作为一种新型环境有机污染物受到了研究者的广泛关注,其生产量和使用量一直处于较高水平且呈现逐年增加的趋势。TDCIPP作为添加剂应用于纺织、家具、电子产品、婴幼儿产品等各行各业中,可经过一系列的转化过程逐渐渗入到环境介质中。环境及生物监测研究发现,在水、室内外空气、土壤、灰尘等环境介质中,甚至鱼类、鸟类等生物体内均检测到不同浓度范围的TDCIPP,有些样本中的含量甚至超越了溴代联苯醚的水平。人类可通过摄食、吸入及皮肤吸收等多种途径暴露TDCIPP,目前已经在人类的尿液、乳汁以及胎盘中都检测到TDCIPP及其代谢产物的存在。因此,评价TDCIPP潜在的毒性以及对环境健康的影响已经刻不容缓。已有研究表明,TDCIPP能够对哺乳类动物产生甲状腺内分泌干扰毒性以及潜在的神经毒性。本研究以多巴胺能神经元模型(PC12细胞)为受试对象,初步探讨TDCIPP的毒性效应以及可能的分子机制。目的建立有机磷酸酯阻燃剂TDCIPP致PC12细胞损伤模型,并观察TDCIPP暴露产生的毒性效应;应用数字基因表达谱(DGE)测序技术筛选TDCIPP暴露致PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证,进而探讨TDCIPP致PC12细胞损伤的毒性作用机制。为评价TDCIPP毒理学机制提供数据支持。方法1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:1.1、实验分组及处理:分化的PC12细胞分为5组:(1)正常对照组(Control组):含有细胞的培养液;(2)TDCIPP暴露组,暴露剂量为7.5,15,30,60?M,共4组。每组设置3-6个复孔。1.2、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:培养PC12细胞并刺激分化为多巴胺能神经元细胞,按实验分组分别暴露TDCIPP 24 h和72 h,采用CCK-8法检测TDCIPP暴露对PC12细胞生存率的影响,并确定TDCIPP的暴露时间;1.3、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP 72 h,采用分子探针DCFH-DA试剂盒,以流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)的含量;采用酶联免疫吸附法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。1.4、TDCIPP对PC12细胞凋亡的影响:分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP 72 h,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒,以流式细胞仪检测细胞凋亡率;并利用Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达量。2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:2.1、实验分组及处理:用于DGE测序分析的实验分组为:正常对照组(C组)以及60?M TDCIPP暴露组(H组);用于qRT-PCR以及Western blot检测的实验分组同1.1小节;暴露时间均为72 h,每个实验均设置3个复孔。2.2、分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP后,运用DGE测序技术检测PC12细胞mRNA表达情况,筛选出差异表达的基因,并通过GO富集和KEGG富集寻找可能的代谢通路产生的影响;2.3、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,选取6个显著表达的差异基因(Myc、p21、Lamb3,col1a1,THBS和CREB),运用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证DGE测序数据的准确性;2.4、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,采用Western blot技术检测PC12细胞中磷酸化PI3K/Akt及非磷酸化PI3K/Akt/Myc/p21蛋白的表达量。结果1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:1.1、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:不同剂量的TDCIPP暴露PC12细胞24 h、72 h后,细胞的生存率均随暴露剂量的升高而降低,呈现剂量效应关系;在相同的暴露剂量下,72 h暴露所致细胞生存率的降低程度高于24 h暴露;当TDCIPP剂量为60μM、暴露72 h时,细胞存活率为(58.15?0.78)%,接近半数致死浓度,故选取72 h作为暴露时间;1.2、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞内ROS的含量呈上升趋势,且在30,60μM剂量时具有显著性差异(P(27)0.01);SOD与GSH的含量随TDCIPP暴露剂量的升高而降低;MDA含量则呈现升高的趋势;1.3、TDCIPP对PC12细胞凋亡的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞凋亡率明显升高,呈现剂量依赖的关系,在15,30,60μM暴露组所致细胞凋亡率的增加具有统计学意义(P(27)0.01),且在最高暴露剂量60μM时,细胞的凋亡率增加了5.7倍;抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,而促凋亡蛋白Bax表达升高,Bcl-2/Bax的相对比值则随着TDCIPP暴露浓度的增加呈现下降的趋势,且各暴露组与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:2.1、DGE测序数据显示:每个样本的数据量均大于3.27G,满足生物信息分析的需要;每个样本的数据与参考基因比对结果均在85%以上,说明测序深度和广度很好;共筛选出161个差异表达的基因,其中49个基因上调,112个基因下调。GO富集和KEGG富集分析结果显示,TDCIPP暴露于PC12细胞后,差异基因多涉及羧酸代谢、氨基酸代谢、PI3K/Akt信号通路及细胞外基质受体等调控通路;2.2、所选取的6个基因的mRNA相对表达量,与DGE测序结果变化趋势相一致;将选取的6个基因的qRT-PCR结果与DGE测序结果进行皮尔逊相关性检验以及简单线性回归分析,结果显示:皮尔逊相关系数为0.801,且P值小于0.01,两者结果呈现显著的正相关性;决定系数R2=0.642,这表明DGE测序结果能较好的代表qRT-PCR检测结果。以上结果表明DGE测序得到的差异表达基因结果可信,能够很好的体现TDCIPP暴露后,对PC12细胞基因的变化情况,以及随之可能引起的毒性效应;2.3、TDCIPP暴露PC12细胞后,PI3K/Akt的磷酸化水平呈现浓度依赖性的降低,非磷酸化水平在各剂量的暴露下均无统计学改变;Myc mRNA与蛋白表达水平降低;p21 mRNA与蛋白表达水平呈现剂量依赖性的上调表达。结论1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:TDCIPP暴露能够降低PC12细胞的生存率;破坏氧化、抗氧化系统的稳定性,使PC12细胞产生氧化应激反应,ROS含量增多,SOD和GSH的含量降低,脂质过氧化产物增多;促使PC12细胞凋亡的产生,从而造成细胞的损伤。2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:利用DGE技术发现,TDCIPP暴露致使PC12细胞产生毒性效应可能归因于抑制了PI3K/Akt信号通路的激活,PI3K/Akt的磷酸化水平降低;Myc mRNA与蛋白水平降低,p21 mRNA与蛋白水平呈现剂量依赖性的上调表达,从而引起PC12细胞凋亡率的增加,造成细胞的损伤。