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目的：探讨应用异型双功能蛋白交联剂N-唬拍酞胺-3-(2-毗吮二硫)-丙酸醋（SPDP）制备穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物的可行性并鉴定其活性、偶联方式。并初步研究穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对人膀胱癌EJ细胞的杀伤作用。为进一步构建高效性穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-抗体酶-前药系统提供实验基础。方法：1、复苏本课题组前期实验构建并鉴定测序后的高表达穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白（CCPs-EGFP）大肠杆菌菌株，对菌株并进行大量培养、诱导表达融合蛋白。采用Ni-NAT Superflow Cartridge层析柱分离纯化；采用还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对融合蛋白分子量大小以及纯度进行鉴定；利用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后融合蛋白的浓度；将融合蛋白与膀胱癌EJ细胞共同孵育,置于荧光显微镜下观察，鉴定其穿膜活性。2、采用异型双功能试剂N一琥珀酰亚胺基一3一(2一吡啶二硫)一丙酸酯（SPDP）交联法将穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白（CCPs-EGFP）、β-葡萄糖苷酶进行共价交联，先利用Ni-NAT Superflow Cartidge层析柱进行第一步分离纯化，再利用Sephadex G-75层析柱进行第二步分离纯化。采用还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对偶联物交联程度、交联方式进行评价及鉴定；将穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物与膀胱癌EJ细胞共同孵育，然后置于荧光显微镜下观察，对偶联物穿膜活性进行鉴定；采用β-葡萄糖苷酶测试盒（DBGD-100）鉴定其酶活性。3、采用MTT法测定穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对膀胱癌EJ细胞生长的抑制作用。结果：1、大量表达、纯化出穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白，目的融合蛋白为可溶性、绿色融合蛋白。经还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定目的蛋白分子量大小约为31KD，纯度较高，无明显的杂带。经BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后融合蛋白的浓度为10.72㎎／ml。将融合蛋白与膀胱癌EJ细胞共同孵育60分钟后,在荧光显微镜下可观察到膀胱癌EJ细胞内有绿色荧光。2、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物SDS-PAGE非还原型电泳高分子量端可见明显条带，而还原型电泳分别在穿膜肽和β-葡萄糖苷酶分子量相应位置可见明显条带；穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物与膀胱癌EJ细胞共同孵育60分钟后，在荧光显微镜下可见明显绿色荧光；经β-葡萄糖苷酶测试盒（DBGD-100）测定,偶联物仍然保持有良好的酶活性，约为同等浓度β-葡萄糖苷酶活性的80%。3、经MTT法测定，穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对膀胱癌EJ细胞生长的抑制作用强于单纯β-葡萄糖苷酶联合苦杏仁苷的作用。结论：成功大量表达、纯化出穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白。利用异型双功能蛋白交联剂SPDP可将该融合蛋白与β-葡萄糖苷酶成功的偶联在一起。分别利用Ni-NAT Superflow Cartidge和Sephadex G-75层析柱可对偶联物进行成功纯化，纯化后穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物仍然保持有良好穿膜活性和酶活性。穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷，在体外可提高对膀胱癌EJ细胞的杀伤作用。该方法可能会解决酶-前药系统分子量大药物难以进入细胞内的问题，并为进一步构建高效性穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-抗体酶-前药系统提供了实验基础。