论文部分内容阅读
猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病。其病原PEDV为单股正链的RNA病毒,易发生变异,给该病的预防和诊断带来了较大困难。本研究从上海地区的养殖场采集部分猪腹泻病病料,通过PCR扩增出S1基因,序列测定后分析其同源性并进行进化树分析,发现本地的新流行株基因发生了缺失突变等变异,与过去的毒株相比同源性较低。另外,将由本实验室分离得到的PEDV流行株SHpd/2012接种到Vero细胞中,通过CPE观察、间接免疫荧光等实验手段研究其侵染Vero细胞的特性,确定流行株SHpd/2012能够感染Vero细胞并致其病变,且病毒侵染细胞时间越长增殖量越大。研究通过序列比对得到流行株SHpd/2012中编码S蛋白的S1与S2基因的序列,利用Oligo6.0软件设计其S1、S2基因的引物,并添加酶切位点与flag标签,将S1与S2基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建了真核表达质粒pCAGGS-S1与pCAGGS-S2。通过脂质体转染试剂将重组质粒分别转染入Vero细胞中,在转染后的24h,48h和72h对其进行间接免疫荧光检测,确定重组质粒能够在Vero细胞中成功表达后,进行大量转染,并在转染48h后提取细胞蛋白。提取的细胞蛋白采用Anti-Flag亲和凝胶进行flag-pulldown实验,收集pulldown后的凝胶进行蛋白电泳,电泳后通过银染检测与S1蛋白或S2蛋白相互作用的蛋白。将银染后的蛋白胶条带分别切下,进行蛋白质谱分析,将质谱结果进行汇总分析并筛选,最终S1组得到268个蛋白质,S2组得到291个蛋白质,然后进行Gene Ontology分析、KEGG Pathway分析,并通过String数据库绘制蛋白互作网络图,初步确定了PEDV在感染Vero细胞时可能与S蛋白发生互作的蛋白质范围。这些鉴定的蛋白质丰富了Vero细胞的蛋白质组学数据库,为新毒株侵染细胞的机制及其致病机理的进一步研究奠定了重要的基础,同时也是更好的进行疾病的防治与诊断工作所不可或缺的一步。