由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病,是对世界烟草产业具有经济重要性的细菌性病害,在热带、亚热带区域发生更为严重。VQ蛋白(FxxxVQxxTG)是植株中广泛存在的一类调节因子,不仅参与植物生长的各项生命过程,而且参与植物对逆境以及病原菌的胁迫应答。迄今,烟草vq基因家族包含哪些重要成员及其在抗烟草青枯病过程中发挥的作用尚不明确。因此,本研究首先利用生物信息学方法对烟草vq基因家族进行鉴定、系统分析其结构特征,并探索该家族成员在不同胁迫下的应答情况。经过系统筛选,筛选出NtVQ35基因。为了探索其在抗青枯病方面的功能,首先利用规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas9)技术(CRISPR/Cas9)和Gateway技术成功获得NtVQ35基因的编辑植株和过表达植株。然后对接种青枯病菌后的编辑植株、过表达株和野生型植株进行症状观察、病情指数统计和叶片内青枯病菌数目统计比较分析;同时对其进行比较转录组分析和水杨酸含量的测定,以期解析NtVQ35在抗青枯菌方面的作用机制。所获得的主要研究结果如下:1)探明烟草vq基因家族可分为I-VIII组,探索了几种处理的应答情况对烟草vq基因家族成员通过生物信息学方法进行系统挖掘和探索,并对其在激素【水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)、生长素(2,4D)】、非生物刺激(包括冷害、热害、伤害)以及病原菌(青枯病菌)处理下的应答情况进行系统分析,结果显示共预测得到59个烟草NtVQ蛋白,根据其氨基酸序列和所含有的多种保守结构域将其分为I-VIII组。其中II、IV、V、VI和VIII组成员可响应一种或多种激素。VII组不响应任何激素刺激。结构域相似的NtVQ基因对不同激素处理具有相似的响应模式。II和V组是响应ET处理最多的组,V组和VIII组是响应ABA最多的组。多数基因受到SA的诱导。温度处理中,NtVQ33和NtVQ34有明显的应答;而伤害处理中NtVQ32,NtVQ46和NtVQ58有明显的应答。半数以上的NtVQ基因受到烟草青枯病菌的诱导。研究发现NtVQ35基因能够同时被SA和青枯病菌高度诱导表达,对该基因的启动子区域分析,发现其启动子区域含有3个胁迫和防御响应相关的富含TC的重复序列。因此推测该基因可能在抗青枯病菌中发挥一定作用。2)初步明确vq基因家族代表基因NtVQ35负向调控烟草青枯病菌的侵染通过CRISPR技术和烟草叶盘法转基因技术成功获得烟草NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和H7-8,通过Gateway技术和烟草叶盘法转基因技术获得NtVQ35过表达遗传品系OE5、OE6和OE8。对获得的NtVQ35基因编辑株和过表达株进行表型观察,发现其跟野生型植株在生长发育上无明显差异,因此推测该基因不影响植株的生长和表型变化。对基因编辑株遗传品系H7-8、过表达株遗传品系OE6和野生型K326烟草分别接种青枯病菌,结果显示过表达植株遗传品系OE6在接种4 d后相较于野生型叶片发生明显萎蔫,病情指数为22.22%,编辑植株遗传品系H7-8相较于野生型植株症状上无特别明显变化,病情指数分别为0.55%,4.45%;9 d后,过表达植株OE6表现为叶片全部萎蔫并且茎基部颜色变黑,野生型植株表现为大部分叶片萎蔫,编辑植株H7-8表现约50%叶片出现萎蔫;过表达植株OE6、野生型植株K326和编辑植株H7-8病情指数分别为90%、71%、48.25%。此外,对接种青枯病菌后3 d的编辑植株H4-8遗传品系、过表达植株OE6遗传品系和野生型K326植株进行症状观察,发现OE6叶片接种部分发生明显的坏死和黄化,野生型接种部位出现明显的黄色晕圈,而H4-8接种部位也出现部分黄色晕圈,但相较于OE6和野生型植株表现不明显。对接种青枯病菌3 d后的叶片进行青枯菌数目的统计,可以看到在编辑植株H4-8中病菌数目最少,H7-8次之,在过表达植株OE6中病菌数目最多,表明编辑植株相较于过表达植株对青枯病菌的抗性更强。综上,NtVQ35在抗青枯病菌中发挥负向调控作用。3)探索了NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有关对接种青枯病菌1 d后的过表达植株遗传品系OE6、NtVQ35基因编辑植株遗传品系H4-8和野生型植株进行转录组测序分析比较,结果表明,KEGG通路中显著富集的与植物抗病性相关的代谢通路主要有黄酮类生物合成代谢途径、植物激素信号转导途径和植物-病原菌互作通路。具体表现为青枯病菌侵染后的编辑植株H4-8中与类黄酮类合成相关的基因表达量高于过表达植株OE6;在PTI途径,编码FLS2、环核苷酸门控通道蛋白(CNGC)的基因表达量显著高于过表达植株OE6,因此推测NtVQ35基因编辑株可能产生更强的基础性免疫;另一方面,在ETI途径,编辑植株H4-8中R基因RPS2相较于过表达植株,被高度诱导,说明其受到青枯病菌无毒基因Avr(效应蛋白)的激发程度高于过表达植株;编辑植株H4-8中SA、ET和BR途径的相关基因的表达量,也明显高于过表达植株,表明编辑植株相较于过表达株更抗青枯病。此外,为探索SA在烟草NtVQ35抗青枯病中发挥的作用,利用高效液相色谱法对接种青枯病菌4 d后的编辑植株H4-8、过表达植株OE6和野生型K326烟草植株中SA含量进行了测定和分析。结果表明,在青枯病菌接种4 d后,编辑植株叶片含有的游离态SA含量水平(656.9 ng/g),显著高于野生型(204.6 ng/g)和过表达植株(164.2 ng/g),因此表明NtVQ35对青枯病菌负向调控作用可能与SA信号转导有相关性。进一步的研究值得跟进。