论文部分内容阅读
癌症作为一种致死率极高的疾病,严重威胁人类的健康和生命,一直以来都是科研工作者的重要研究对象。化学疗法作为一种传统的临床治疗手段在癌症治疗中得到广泛应用。然而,化疗药物在治疗癌症的同时往往对患者造成较为严重的毒副作用。此外,长期连续性的给药也经常会诱发肿瘤产生多药耐药性,进而导致治疗失败。纳米技术的兴起为克服这些难题带来了新的曙光。纳米载体由于具有纳米级尺寸、比表面积大、物理化学性质可调等特征,能够增强药物的稳定性,提高疏水性药物的溶解性,改善药物在体内的分布,近年来在癌症治疗中得到广泛的应用。线粒体不仅是细胞能量的源泉,也是调控细胞代谢和死亡的枢纽。线粒体靶向纳米药物是近年该领域的研究热点,在提高药物抗癌效果以及克服肿瘤耐药性等方面具有重要意义。本文在实验室前期工作基础上,系统研究了两类肿瘤微环境(包括肿瘤细胞还原性和肿瘤组织微酸性)活化的线粒体靶向纳米药物,对两类可活化线粒体靶向纳米药物的制备、理化性能、与肿瘤细胞的相互作用、在细胞内的转运、定位以及体外、体内抗肿瘤性能进行了系统的研究。主要内容包括:第一章,主要介绍了癌症治疗的研究现状以及多种刺激响应性纳米载体的构建,对肿瘤微环境在纳米载体设计中的重要作用作出了简要概述。重点归纳了多种线粒体靶向纳米载体,如脂质体、无机纳米载体、聚合物纳米载体、脂质-聚合物纳米粒子等在癌症治疗中的应用。此外,对肿瘤化疗耐药性的产生及应对策略也进行了总结。第二章,制备了负载抗癌药物青蒿素(ART)的胞内还原活化线粒体靶向纳米药物ART-PLGA/CPT/DSSP,系统评价了其体外和体内抗癌性能。亚铁血红素(heme)是ART在细胞中的活化剂,主要在线粒体中合成,heme在癌细胞中生物合成的量远大于正常细胞。将ART高效精准递送到线粒体中有利于提高其抗肿瘤效果。实验结果表明,游离ART本身对多种癌细胞的毒性很小,而线粒体靶向输送(ART-PLGA/CPT/DSSP)显著提高ART对多种癌症细胞的毒性,如对MCF-7细胞的半致死量(IC50 0.38μg/m L)仅为非线粒体靶向ART-PLGA/CPO/DSSP(IC50 3.97μg/m L)的十分之一。发现MCF-7细胞经ART-PLGA/CPT/DSSP处理后,在线粒体内特异性持续产生有毒的ROS,损伤线粒体,导致线粒体膜电位显著降低和线粒体生物能量代谢水平明显下降,通过线粒体依赖的凋亡途径诱导癌细胞死亡。我们还发现,自由基清除剂TEMPO和Mito TEMPO能显著降低ART与heme在线粒体产生的有毒自由基对MCF-7细胞的毒性。而且ART与heme作用产生ROS的过程不依赖于氧气,有助于ART-PLGA/CPT/DSSP在缺氧的实体肿瘤中表现出良好的抗肿瘤效果。游离ART和ART-PLGA/CPO/DSSP在给药12天后,肿瘤抑制率(TIR)分别只有18.8%和23.1%,而线粒体靶向ART-PLGA/CPT/DSSP表现出优异的体内抗肿瘤效果,治疗12天后肿瘤抑制率(TIR)高达91.2%。青蒿素是一种在世界范围内长期使用的抗疟疾药物,安全性好。我们构建的线粒体靶向输送青蒿素纳米药物显著提高了青蒿素的抗肿瘤效果,有望进一步开发具有临床应用价值的青蒿素抗癌药物。第三章,ART-PLGA/CPT/DSSP虽然具有良好的体内外抗肿瘤效果,然而,ART在达到一定浓度后,细胞毒性几乎不再增强,并不能完全杀死癌细胞,而且在体内抗肿瘤治疗后期,肿瘤呈明显生长趋势。我们分析可能的原因是,癌细胞内谷胱甘肽过氧化物酶GPX4可修复脂质过氧化性损伤,降低了ART在线粒体内产生的自由基或ROS对细胞造成的损伤。为逆转癌细胞对ART治疗产生的抵抗,我们构建了线粒体靶向ART/GPX4抑制剂((1S,3R)-RSL3)组合纳米药物A/R-PLGA/CPT/DSSP。发现线粒体靶向共输送RSL3/ART对MCF-7细胞的毒性表现出协同作用。RSL3在线粒体中与GPX4特异性结合并使其失活,一方面导致MCF-7细胞发生铁死亡,另一方面降低了细胞通过GPX4对ART在线粒体中产生的自由基或ROS的抵抗。A/R-PLGA/CPT/DSSP纳米药物中ART和RSL3二者的协同作用,不仅在细胞水平提高了杀死MCF-7细胞的能力,在体内也表现出优异的抗肿瘤效果。静脉注射A/R-PLGA/CPT/DSSP纳米药物18天后,对裸鼠皮下MCF-7肿瘤生长的抑制率(TIR)高达93.7%,显著高于单药对照组ART-PLGA/CPT/DSSP(69.9%)。我们的结果证明从肿瘤分子生物学出发,构建线粒体靶向组合纳米药物,可有效提高青蒿素的抗肿瘤能力,为发展高效的青蒿素抗癌药物提供了新的思路。第四章,我们利用聚乙烯亚胺(PEI)和2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)合成了肿瘤酸度触发电荷反转的阴离子聚合物PEI-DMMA(PD)。PD通过静电相互作用吸附在正电性DOX-PLGA/CPT的表面,得到DOX-PLGA/CPT/PD,发现DOX-PLGA/CPT/PD可有效克服MCF-7/ADR肿瘤的耐药性。MCF-7/ADR肿瘤细胞的耐药主要是由于癌细胞经阿霉素(DOX)处理后过度表达药物泵出蛋白。其主要分布在细胞膜和核膜,而在线粒体中没有药物泵出蛋白。DOX不仅可以与细胞核中的核酸作用,也可以与线粒体中的核酸作用,导致细胞中的mt DNA受损。然而,DOX自身难以穿过线粒体膜进入线粒体。我们通过大量的细胞实验和动物实验证明了肿瘤酸度触发电荷反转纳米药物DOX-PLGA/CPT/PD,在血液循环过程中(p H 7.4),PD能够稳定存在,表面呈负电性,避免了非特异性蛋白吸附,延长了其血液循环时间,增加了纳米粒子在肿瘤部位的富集。一旦到达弱酸性的肿瘤部位(p H 6.5-6.8),PD中的酰胺键则会快速发生水解,转变为正电荷的PEI,与TPP之间失去了静电相互作用而脱离,从而暴露出内层正电荷的DOX-PLGA/CPT,纳米药物的正电性增加了耐药细胞MCF-7/ADR的摄取。进入细胞后,DOX包封在线粒体靶向纳米粒子中,一方面避免耐药细胞对DOX的泵出,另一方面又能够将DOX靶向输送到线粒体中。DOX释放后,与线粒体DNA结合发挥独特的抗癌作用。DOX-PLGA/CPT/PD在细胞水平和整体动物水平均表现出克服MCF-7/ADR耐药的能力。我们构建的肿瘤酸度活化线粒体靶向纳米药物平台并不局限于DOX的输送和克服MCF-7/ADR耐药,有望用于各种能在线粒体发挥作用的疏水性抗癌药物的输送,也有可能应用于其它耐药肿瘤的治疗。