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人促卵泡生长素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。在不孕不育的诊断和治疗中,FSH发挥着重要作用。目前国内市场上主要尿源促卵泡生长素(uFSH)以及进口的基因重组人促卵泡生长素(rhFSH),暂时还未发现上市的国产rhFSH。rhFSH具备和天然FSH一样的生物活性,并且基因工程方法生产的rhFSH具有纯度高、来源均一、安全性好的特点。理论上用基因工程方法可生产大量高纯度的rhFSH,因此本课题通过基因工程方法制备rhFSH并验证其功能具有一定的研究价值。本研究在获取了人FSHα以及FSHβ亚基基因序列的基础上,通过设计特异性引物,采用PCR方法扩增得到人FSHα亚基基因以及FSHβ亚基基因。将得到的FSHα亚基基因序列克隆至pIRES-Hyg3质粒构建了p IRES-Hyg3-FSHα表达载体,将FSHβ亚基基因的编码序列克隆至pIRES-Puro3以及pIRES-Neo质粒分别构建了pIRES-Puro3-FSHβ和p IRES-Neo-FSHβ表达载体,通过琼脂糖凝胶电泳以及送测序公司验证,结果表明成功地构建了pIRES-Hyg3-FSHα、pIRES-Puro3-FSHβ和p IRES-Neo-FSHβ真核表达载体。利用Lipofectamine 2000将建构好的表达载体共转染到CHO以及HEK-293细胞中,再用潮霉素B、G418和嘌呤霉素加压筛选得到单克隆细胞株。将单克隆细胞株扩大培养,并裂解细胞提取蛋白,通过Western Blotting方法检测目的蛋白,结果说明细胞表达的rhFSH大小与预期一致。同时建立了两套双抗夹心ELISA检测方法来检测rhFSH的含量,通过稀释法结合ELISA筛选出表达量高的单克隆细胞株。在鉴定rhFSH的生物学功能上,本研究建立了促卵泡生长素受体(FSHR)介导rhFSH进入细胞膜内的细胞实验模型,通过细胞膜荧光内在化的现象从细胞水平上验证rhFSH的生物活性;另外还将纯化得到的rhFSH进行小鼠体内促排卵实验,实验结果发现小鼠排卵数目是空白对照组的小鼠排卵数目的4-10倍,表明rhFSH在小鼠体内也具备生物活性。本研究成功构建了pIRES-Hyg3-FSHα、pIRES-Puro3和pIRES-Neo真核表达载体,并得到了稳定表达rhFSH的CHO和HEK-293细胞株;通过体内动物实验和体外细胞实验验证了基因工程制备的rhFSH纯度高且具备很好的生物学活性。