【摘 要】
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非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virtual,ASFV）感染猪而引起的一种急性、烈性传染病,非洲猪瘟具有高度传染性,首次报道于20世纪20年代初,我国首次在2018年8月在辽宁省沈阳市发现,随后在全国迅速传播,给我国养殖业带来巨大的经济损失。非洲猪瘟病毒是目前已知的唯一一种DNA虫媒病毒,其基因组为线性双链DNA,编码的蛋白质有150~200个。CD2
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:32170161）
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非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virtual,ASFV）感染猪而引起的一种急性、烈性传染病,非洲猪瘟具有高度传染性,首次报道于20世纪20年代初,我国首次在2018年8月在辽宁省沈阳市发现,随后在全国迅速传播,给我国养殖业带来巨大的经济损失。非洲猪瘟病毒是目前已知的唯一一种DNA虫媒病毒,其基因组为线性双链DNA,编码的蛋白质有150~200个。CD2v蛋白为囊膜蛋白,由EP402R基因编码,大小约45 k Da,此蛋白是一个糖蛋白,由跨膜区、信号肽以及2个免疫球蛋白样的结构域组成。因为猪红细胞表面有CD2配体,所以ASFV感染后CD2v蛋白能使病毒颗粒与周围的红细胞发生吸附结合,促进病毒在血液中扩散。1.ASFV CD2v原核及重组杆状病毒的表达与鉴定将已构建的p ET-28a-CD2v-N-Fe转化至BL21大肠杆菌感受态,加入IPTG诱导,进行原核表达并纯化,进行SDS-PAGE验证。结果显示成功纯化出CD2v-N-Fe蛋白。同时选择NCBI上的A0A0A7W5A6ASF氨基酸序列作为原始序列,对其中CD2v核苷酸序列进行分析、密码子优化后进行基因合成,插入到p Fast BacTMHT-CAT质粒中得到重组转移质粒p Fast Bac-CD2v-full（全长）及p Fast Bac-CD2v-N（N端）,将其转化到DH10Bac大肠杆菌感受态,进行蓝白斑筛选,经过三轮筛选得到重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CD2v-N及Bacmid-CD2v-full。将其从感受态中抽提,转染到Sf9细胞中,待观察到细胞出现病变后进行传代,连续传代三次后得到重组杆状病毒CD2v,分别通过间接免疫荧光试验及Western Blot检测,确定所构建的CD2v重组杆状病毒已经成功表达,并且利用猪高免血清验证表达蛋白为CD2v。2.ASFV CD2v蛋白单克隆抗体的制备在之前的一些试验中发现用CD2v重组杆状病毒表达并纯化蛋白,在免疫小鼠后无法进行单克隆抗体的后续筛选,于是将原核表达系统纯化的蛋白CD2v-N-Fe按照一定的免疫程序免疫SPF级BALB/c小鼠,免疫结束后检测抗体滴度,选择抗体滴度较高的小鼠脾脏B细胞,利用PEG介导小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合,利用筛选培养基筛选出目的细胞株后进行扩大培养,再进行亚克隆得到单克隆细胞株,同时进行ELISA、间接免疫荧光、Western Blot检测,得到一株阳性细胞株3C11B5。扩大培养后,以5×105个细胞腹腔注射到小鼠腹腔内,一周后收取腹水进行抗体滴度及抗体特性检测,结果显示腹水抗体滴度可达1:204800,并且可以识别CD2v转染293T细胞表达的蛋白及CD2v杆状病毒重组蛋白,ASFV感染Vero细胞后表达的CD2v蛋白可以识别。综上,本研究将CD2v原核表达质粒进行表达纯化,免疫小鼠后制备鼠源CD2v单克隆抗体,获得一株单克隆细胞株3C11B5,同时成功构建CD2v全长及N端的杆状病毒表达系统,为区分我国缺失CD2v野毒株及研究非洲猪瘟感染机制奠定了基础,CD2v杆状病毒表达系统的建立为建立相应的ASFV检测方法和亚单位疫苗提供帮助。
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