目的人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，RSV）广泛流行于世界各地，是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原。目前尚无安全、有效的疫苗用于预防RSV感染。RSV两个重要的糖蛋白膜表面表达的融合蛋白F（fusion protein，F）和粘附蛋白G，是激发机体产生中和抗体的主要蛋白，也是疫苗研究发展的重要内容。与G蛋白相比，F蛋白有更多的抗原识别位点，不同亚型间F蛋白高度保守、同源性高达86％，能刺激机体产生体液免疫及细胞免疫应答，针对F的中和抗体具有交叉保护作用，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。辅助病毒依赖型腺病毒载体（helper-dependent adenoviral vector，HDAd）主要用于基因治疗研究，作为疫苗载体的研究起步较晚，尚没有作为黏膜基因释放系统用于疫苗研究的报道。HDAd与腺病毒具有相同的细胞嗜性，对呼吸道上皮细胞具有高效感染的能力，且能长期、持续表达转基因，具有重要的研究与使用价值。本研究拟构建可表达A亚型RSV F蛋白的辅助病毒依赖型腺病毒载体（HDAd／F），并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定，为进一步的体内免疫效果和免疫保护作用研究奠定基础。方法将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11，鉴定正确后，克隆至HDAd质粒pSC15B，构建pSC15B／F HDAd重组质粒，PmeⅠ消化pSC15B／F去除原核复制元件及抗性基因，获得HDAd／F DNA分子，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16 h后感染辅助病毒，收获HDAd／F载体粗提液，随后以HDAd／F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd／F达到复制极限，同时以可表达β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。大量制备HDAd／F，CsCl密度梯度及等密度梯度两次超速离心纯化，利用分子生物学技术体外鉴定HDAd／F表达情况。结果成功构建了可表达RSV F蛋白的HDAd／F载体，通过与辅助病毒共感染293Cre4细胞及CsCl梯度法超速离心制备了大量纯化的HDAd／F载体，透射电镜观察显示HDAd的直径约为70 nm，具有典型的腺病毒形态，运用分光光度测定法分析表明纯化后HDAd载体颗粒浓度为：7.4×10¹²（vp／ml），体外感染293细胞，RT-PCR检测到F基因有转录，Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。结论成功构建HDAd／F载体并在真核细胞中实现表达，为体内免疫学效力试验奠定基础，为研制RSV疫苗提供了一种新方法。