论文部分内容阅读
研究背景:目前,由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的艾滋病痴呆综合症(AIDS-dementia complex,ADC)具体机制尚不清楚。已有研究显示,巨噬细胞和小胶质细胞(Macrophage and microglia,M phi)活化释放的炎性因子和过氧化物等有害物质对中枢神经系统(Central nervous system,CNS)内的其他细胞产生损害或导致细胞凋亡等活动参与ADC的病理生理过程。HIV-1病毒包膜糖蛋白-120(Glycoprotein-120,gp120)是引起神经毒性反应的主要病毒分子之一,在病毒识别与结合宿主细胞表面受体等方面具有重要作用。研究发现,在体或侧脑室注射gp120可造成新生或成年大鼠脑损伤,且M phi的活化与gp120的神经毒性有关。P2X7受体涉及炎症和免疫反应,在调节小胶质细胞的功能活动中具有重要作用,并与神经退行性疾病密切相关。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)可通过激活P2X7受体活化小胶质细胞,从而引起炎性因子释放。以上研究表明,P2X7受体可能成为ADC防治的新靶点。柚皮苷(Naringin)是一类天然黄酮类物质,具有抗炎、抗氧化应激、糖脂代谢调节及心肌保护等特性,提示柚皮苷可能对P2X7受体介导的gp120所致小胶质细胞损伤有一定的保护效应。因此,研究柚皮苷是否对P2X7受体介导的gp120所致小胶质细胞损伤起保护作用,对扩宽柚皮苷的应用范围和探索ADC潜在的治疗手段等方面具有重要意义。目的:本研究应用gp120处理小胶质细胞建立细胞损伤模型,在细胞水平上研究P2X7受体是否参与gp120诱导的小胶质细胞损伤以及柚皮苷的保护作用。方法:本课题研究对象为BV2小胶质细胞株和大鼠原代培养小胶质细胞。应用MTS法检测各浓度gp120对BV2小胶质细胞活性的影响;通过MTS或TUNEL法检测BV2小胶质细胞/原代培养小胶质细胞的损伤或凋亡情况;通过免疫细胞化学或免疫荧光双标法分别检测BV2小胶质细胞/原代培养小胶质细胞P2X7受体的表达;通过qPCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)和Western Blot分别检测BV2小胶质细胞/原代培养小胶质细胞P2X7 mRNA和受体蛋白及BV2小胶质细胞P65 NF-κB的表达;应用试剂盒检测BV2小胶质细胞上清液中NO的含量及细胞内ROS的水平,并分别检测了BV2小胶质细胞/原代培养小胶质细胞上清液中TNF-α、IL-1β或eATP的含量。结果:1.通过免疫荧光法检测小胶质细胞特异性标志物CD11b,结果发现BV2小胶质细胞/原代培养小胶质细胞纯度分别在99%和90%以上,完全符合后期实验要求。2.gp120建模浓度筛选:MTS结果显示,与Ctrl组相比,浓度为1.0μg/L的gp120处理组细胞活性在90%以上(P<0.05),2.0μg/L处理组细胞活性为80%左右(P<0.01),而4.0μg/L和8.0μg/L处理组细胞活性均降至60%以下(P<0.01);BV2小胶质细胞P2X7 mRNA和受体蛋白表达的检测结果显示,在一定浓度范围内,随着gp120浓度增加,BV2小胶质细胞P2X7 mRNA和受体蛋白的表达水平呈上升趋势,且2.0μg/L浓度的gp120能使细胞P2X7 mRNA和受体蛋白表达显著上调。因此,选用2.0μg/L浓度的gp120用于建立小胶质细胞损伤模型。3.柚皮苷用药浓度筛选:MTS结果显示,1μM浓度柚皮苷处理组细胞活性与Ctrl组相比无明显差异(P>0.05),10μM和100μM处理组细胞活性约在95-75%之间,而1000μM处理组的细胞明显大量死亡;以gp120为模型在10-160μM之间设置柚皮苷浓度梯度,结果显示,40μM柚皮苷开始对细胞活性产生保护效应,与Ctrl组相比差异有统计学意义(P<0.05);而80μM柚皮苷具有显著性差异(P<0.01),故以此柚皮苷浓度用于实验。4.MTS检测BV2小胶质细胞活性:与Ctrl组相比,gp120组和gp120+PBS组BV2小胶质细胞活性显著下降(P<0.01);与gp120组相比,gp120+Naringin组和gp120+BBG组BV2小胶质细胞活性均有所升高(P<0.05),且此两组间无明显差异(P>0.05)。5.TUNEL检测原代培养小胶质细胞凋亡:与Ctrl组相比,gp120可引起原代培养小胶质细胞大量凋亡(P<0.01);而柚皮苷对gp120所致的原代培养小胶质细胞凋亡有一定的保护作用(P<0.01),DMSO作为柚皮苷药物溶剂对本实验无明显影响(P>0.05)。6.BV2小胶质细胞P2X7 mRNA/受体和P65 NF-κB的表达:PCR、Western Blot和免疫组化结果显示,gp120组和gp120+PBS组的P2X7受体表达与Ctrl组相比均显著上调(P<0.01),gp120+BBG组表达量明显下降(P<0.01),且BBG组与Ctrl组之间无明显差异(P>0.05);与gp120组相比,gp120+Naringin组的P2X7 mRNA和受体蛋白及P65 NF-κB表达均明显下降(P<0.01)。7.原代培养小胶质细胞P2X7 mRNA和受体检测结果:gp120组细胞P2X7mRNA和受体蛋白的表达均明显高于Ctrl组(P<0.01),且与gp120+DMSO溶剂对照组无明显差异(P>0.05);与gp120组相比,gp120+Naringin组P2X7 mRNA和受体蛋白的表达明显降低(P<0.01)。8.BV2小胶质细胞过氧化物和炎性因子检测结果:与Ctrl组相比,gp120组BV2小胶质细胞上清液中NO、TNF-α和IL-1β含量增加及细胞内ROS升高,差异均有统计学意义(P<0.01);gp120+Naringin组细胞上清液中NO含量与gp120组相比显著下降(P<0.01)。9.大鼠原代培养小胶质细胞eATP、TNF-α和IL-1β检测结果:与Ctrl组相比,gp120组细胞上清液中eATP、TNF-α和IL-1β含量均显著增加(P<0.01),而gp120+Naringin组eATP、TNF-α和IL-1β含量与gp120组相比均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。结论:HIV-1病毒包膜糖蛋白gp120可引起小胶质细胞损伤/凋亡;P2X7受体介导gp120所致小胶质细胞损伤/凋亡,且柚皮苷对其具有一定的保护作用。