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目的:本论文旨在运用骨肉瘤细胞株和裸鼠原位移植瘤模型,探索芪重散中主要有效成分抗骨肉瘤的作用和分子机制,以期为今后芪重散的临床施治提供一定的理论基础。方法:1.芪重散中抗骨肉瘤有效成分的筛选运用x CELLigence实时细胞检测仪和CCK-8技术分别检测芪重散中有效成分对骨肉瘤细胞存活率的影响,运用流式细胞仪检测细胞凋亡,筛选主要有效成分。2.芪重散有效成分斑蝥素体内外抗骨肉瘤的作用研究运用x CELLigence实时细胞检测仪检测斑蝥素对骨肉瘤细胞迁移和浸润能力的影响;流式细胞仪检测斑蝥素对骨肉瘤细胞周期和凋亡的影响;Western Blot检测斑蝥素对细胞周期、迁移、浸润和凋亡相关蛋白表达水平的影响。观察斑蝥素对裸鼠原位移植骨肉瘤模型的肿瘤体积及裸鼠体重和骨质的影响。3.斑蝥素抗骨肉瘤的分子机制研究Micro RNA基因芯片检测和筛选组织中差异表达的mi RNAs,实时荧光定量PCR进一步验证组织中mi R-214表达水平;实时荧光定量PCR检测不同人骨肉瘤细胞株(143B、MG-63和U-2 OS细胞)及人成骨细胞h FOB 1.19中mi R-214表达水平。检测mi R-214过表达和敲降后对骨肉瘤细胞存活率、迁移和克隆形成能力的影响;用生物信息学预测mi R-214靶基因,并用Western Blot检测进行验证。实时荧光定量PCR检测斑蝥素对骨肉瘤细胞中mi R-214表达水平的影响;检测斑蝥素对mi R-214过表达和敲降骨肉瘤细胞存活率、迁移和克隆形成能力的影响。Western Blot检测斑蝥素对Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响。结果:1.芪重散中有效成分斑蝥素呈时间和浓度依赖性降低143B和U-2 OS骨肉瘤细胞的存活率,毛蕊异黄酮呈浓度依赖性降低143B骨肉瘤细胞的存活率,黄芪甲苷对骨肉瘤细胞凋亡无明显作用,重楼皂苷III、VI和VII呈浓度依赖性降低143B骨肉瘤细胞的存活率,斑蝥素和重楼皂苷I联合使用具有协同作用。2.斑蝥素呈浓度依赖性抑制143B和U-2 OS骨肉瘤细胞的迁移和浸润能力,同时抑制Vimentin蛋白的表达;斑蝥素呈浓度依赖性诱导143B和U-2 OS骨肉瘤细胞凋亡,同时抑制Bcl-2蛋白表达,并上调Cleaved PARP蛋白表达;斑蝥素呈浓度依赖性使细胞周期阻滞于M期,同时抑制Cyclin E2、Phospho-cdc2(Tyr15)和Phospho-Weel(Ser642)蛋白表达,并上调Cyclin B1和Phospho-Histone H3(Ser10)蛋白表达。斑蝥素可抑制胫骨内原位骨肿瘤模型裸鼠肿瘤的生长,对小鼠体重无明显影响,小鼠胫骨结构完整,骨质未见明显受损。3.基因芯片检测结果显示,骨肉瘤患者瘤体组织中mi R-214表达水平显著高于其自身对照组织;实时荧光定量PCR验证结果与基因芯片结果一致,并且143B、MG-63和U-2 OS骨肉瘤细胞中mi R-214表达水平显著高于人成骨细胞h FOB1.19。mi R-214过表达可促进骨肉瘤细胞存活率、迁移和克隆形成,mi R-214敲降后可降低骨肉瘤细胞存活率、迁移和克隆形成能力;生物信息学预测结果显示LEF1是mi R-214的潜在靶基因;mi R-214正向调控骨肉瘤细胞中LEF1蛋白表达促进骨肉瘤生长。斑蝥素呈浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞中mi R-214表达水平;斑蝥素可下调mi R-214/LEF1信号轴特异性抑制骨肉瘤细胞生长。斑蝥素可抑制Wnt/β-Catenin信号通路中磷酸化GSK-3β(Ser9)和β-Catenin蛋白表达。结论:斑蝥素通过下调Wnt/β-Catenin信号通路抑制骨肉瘤的生长。斑蝥素通过下调mi R-214/LEF1信号轴抑制骨肉瘤的生长。