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创面修复是烧创伤领域的重要课题,创面延迟不愈给患者、家庭及社会带来了严重负担。人脐带间充质干细胞（Human umbilical mesenchymal stem cell,hUMSC）是一种多能干细胞,具有强大的自我更新和多向分化能力,对组织重建和创面修复具有积极意义。hUMSC外泌体是hUMSC特异性分泌的纳米膜泡（50-150nm）,包含了复杂蛋白质、核酸和脂质等,参与细胞间通讯,发挥免疫调节、抑制氧化应激、抗炎、抗纤维化和增强血管生成等作用,越来越多的研究认为,外泌体是hUMSC发挥效用的关键因素之一。相关研究表明,干细胞外泌体对皮肤软组织各类创面修复具有积极作用。然而,由于提纯技术的局限,目前外泌体的提取工艺耗时长、成本高、纯度低。因此,我们拟探索物理过膜挤压技术,制备工程化hUMSC类外泌体纳米囊泡,模拟干细胞外泌体的双层膜结构,保留干细胞发挥作用的有效内容物;并基于皮肤创面组织全层损伤的微环境改变特点,使用甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶（Gelatin-methacryloyl,GelMA）递送hUMSC类外泌体纳米囊泡,构建工程化hUMSC类细胞外囊泡的填充缓释系统,以探讨这种工程化类外泌体纳米囊泡对于创面修复和组织重建的应用效果;并进一步将其与细胞天然分泌外泌体的组成成分、发挥效用机制等进行比较,探究其是否参与创伤后炎症反应、促进血管再生、诱导组织重建等生理过程,理解其发挥作用机制。希冀本研究可为凝胶搭载hUMSC工程化类外泌体囊泡促进创面修复和组织重建的临床应用提供理论依据,拓展软组织创面修复的新思路。第一部分工程化hUMSC类外泌体纳米囊泡的制备与搭载研究目的:制备、分离、提纯工程化hUMSC类外泌体囊泡和天然hUMSC外泌体,并进行鉴定,观察和探讨类外泌体囊泡的形态及性质。研究方法:将hUMSC培养至临床应用的最佳代数（3～8代）,收取培养上清液,用超速离心法分离提纯hUMSC外泌体;将培养的hUMSC通过物理过膜挤压技术制成工程化hUMSC类外泌体囊泡悬液,用超速离心法分离提纯hUMSC类外泌体囊泡。提取完成后,使用透射电子显微镜、粒径分析及Western blot技术对hUMSC类外泌体囊泡和hUMSC外泌体的形态、粒径和表面特异性标志物进行鉴定观察。研究结果:除部分差异,hUMSC类外泌体囊泡和外泌体的形态和粒径分布相似,但它们的表面特异性标志物差异较大,可能与生物发生不同相关。研究结论:hUMSC类外泌体囊泡和外泌体均具有纳米结构,且有良好的生物相容性。从形态学、生物相容性的角度来看,类外泌体囊泡可以很好地模拟天然外泌体。第二部分工程化hUMSC类外泌体一凝胶填充缓释系统对创面修复作用的研究研究目的:研究工程化hUMSC类外泌体囊泡—凝胶填充缓释系统对创面修复和组织重建的作用。研究方法:将成人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast,HDF-a）培养至稳定传代状态,分为空白对照组、hUMSC外泌体组、工程化hUMSC类外泌体囊泡组,采用 EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）实验、cck-8（Cell counting kit-8）实验和划痕实验等对工程化hUMSC类外泌体囊泡促进细胞增殖和迁移的情况进行测定。采用小鼠全层皮肤损伤模型,分为空白对照组、hUMSC外泌体组、工程化hUMSC类外泌体囊泡组、凝胶搭载hUMSC外泌体组和凝胶搭载工程化hUMSC类外泌体囊泡组处理损伤模型,于造模3天、7天和14天分别拍照记录和收集各组小鼠的皮肤组织,对创面大小进行测量,皮肤组织制备切片进行苏木精—伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）和免疫组化染色,测定ki67等组织修复相关信号蛋白的表达情况。研究结果:体外实验结果显示,外泌体和工程化类外泌体囊泡（Exosome Mimetics,EMs）均能促进成纤维细胞的增殖和迁移,且在某些浓度下,EMs有更好的促增殖或迁移效果。体内实验中,通过对组织形态学、免疫组化的评估分析,我们发现凝胶搭载EMs有显著的促创面修复效果。研究结论:体内和体外实验结果表明,EMs可以促进成纤维细胞的增殖和迁移,对创面修复不仅有和外泌体相当的效用,经凝胶搭载后会发挥更佳效能,有极大的临床转化潜力。第三部分工程化hUMSC类外泌体囊泡对创面修复作用调控机制的研究研究目的:进一步探索工程化hUMSC类外泌体囊泡对创面修复和组织重建的作用机制。研究方法:采用非标（Label-free）蛋白质组定量技术对hUMSC外泌体和EMs的蛋白质进行蛋白测定和相对定量。识别出的蛋白信息进行一系列质控测定以保证结果质量符合标准,将信息在数据库进行检索后,对鉴定到的所有蛋白质从亚细胞结构定位、基因本论（Gene Ontology,GO）以及 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路等方面进行详细的功能注释。研究结果:蛋白质组学结果显示,比起外泌体,EMs富集大量蛋白,从亚细胞结构来看,其促创面修复作用可能和线粒体的功能有关;经GO及KEGG分析表明,其作用也可能与 Notch、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、JAK/STAT3、Ras/ERK 等经典信号通路相关。研究结论:EMs相较于外泌体富集大量蛋白,其促创面修复作用与多个生物过程有关,如线粒体能量代谢、Notch信号传导等。