研究背景与目的自然流产已经成为一种常见的医学问题,大约有25%的育龄期妇女怀孕会经历自然流产。早期自然流产(SA)发生在妊娠20周以前,是人类孕期常见的生殖失败之一。SA的潜在发病机理主要包括胎儿染色体异常、内分泌失调和免疫因素。然而,这些致病因素如何最终导致流产及其发生的分子机制尚不清楚。滋养层是上皮细胞系的胎盘细胞并且最终区别于普通的细胞滋养层祖细胞分化成为对胎盘发育至关重要的高度特异性细胞。众所周知,一些胎儿和母体因素影响胎盘的生长和滋养层细胞的功能,并且导致严重的妊娠相关疾病,包括早期自然流产(ESA)、先兆子痫等。长链非编码RNA(lnc RNA)是一类转录长度超过200核苷酸的不编码蛋白的RNA。lnc RNAs最初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物,被称为“暗物质”,不具有生物学功能。近年来,全基因组转录组学分析发现大量动态表达的lnc RNAs,其中许多参与各种生物学功能。以往研究证实,lnc RNAs通过相关基因表达的调控在胚胎生长和肿瘤发生中起重要作用。而且,近来研究发现lnc RNAs在SA和人工流产(IA)的胎囊及蜕膜中表达不同,表明lnc RNAs在SA的发生中扮演了重要的角色。其中,lnc RNAs-H19在胎肝和胎盘中高表达;一项研究表明lnc RNAs-H19的主要生理作用之一是在胎儿出生前通过mi R-675的途径限制胎盘的生长。此外,在人滋养层细胞系JEG-3细胞中,印记基因H19的敲除或mi R-675的限制都具有促增殖作用。然而,mi R-675的表达仅在胎盘发育的晚期才表达,而H19却能在胎盘发育的早期持续高表达。因此,这就产生了两个问题:H19在胎盘发育早期高表达的生理作用及病理意义是什么?在胎盘发育早期mi R-675不表达的情况下,H19的作用机制是什么?在本研究中,我们分析lnc RNAs-H19在早期自然流产和人工流产临床样本中的表达情况,进一步验证H19上调表达的临床意义,并在细胞水平上过表达H19,研究其对人滋养层细胞HTR-8/SVneo的调节作用及进一步深入探讨H19的作用机制。材料与方法本课题中,我们首先从外院分别收集22例早期自然流产绒毛组织及人工流产绒毛组织,利用抽提RNA、反转录及实时定量PCR技术,检测lnc RNA-H19在绒毛组织中的表达水平。紧接着,我们在人滋养层细胞中过表达lnc RNA-H19,应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)技术检测H19的细胞增殖水平的变化。并且利用Transwell检测方法(Millipore)、基质胶试剂(BD)在人滋养层细胞中检测过表达H19的侵袭能力改变情况。为了进一步探索机制,本研究利用RNA pull down技术及质谱分析筛选出人滋养层细胞中lnc RNA-H19的相关结合蛋白,并运用Western blot、RIP技术及免疫荧光技术验证H19与相关结合蛋白的关系,并检测出H19的作用机制。同时,本课题应用全基因组DNA甲基化试剂盒(Epigentek,Farmingdale,NY,USA)、焦磷酸测序方法分别检测人滋养层细胞中的全基因组DNA甲基化水平及H19的启动子区甲基化水平变化情况。研究结果1.lnc RNAs-H19在早期自然组织中上调表达,并与H19在差异甲基化区域(DMR)的低甲基化水平一致。在早期自然流产和人工流产的绒毛组织中行RT-PCR检测,结果显示lnc RNA-H19在ESA绒毛组织中高表达而在IA绒毛组织中较低表达。按照全基因DNA甲基化试剂盒说明检测,结果发现在ESA患者绒毛组织中的DNA甲基化水平明显低于IA患者绒毛组织;进一步通过焦磷酸盐测序的方法检测,结果显示lnc RNA-H19启动子区在ESA患者绒毛组织中较IA患者的绒毛组织具有较低水平的甲基化状态。2.过表达H19能够抑制滋养层细胞HTR-8/SVneo的生长和侵袭能力。本研究中,在滋养层细胞HTR-8/SVneo中过表达H19,结果显示H19过表达组在滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞的表达较对照组明显增高;研究结果还发现,H19的上调表达抑制滋养层细胞HTR-8/SVneo的增殖能力;进一步研究证实,在过表达H19后明显抑制滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力。3.在作用机制的深入研究中,通过RNA pull down技术和质谱分析发现,lnc RNAs-H19在滋养层细胞HTR-8/SVneo中的结合蛋白DDX-3。本研究中通过RNA pull down技术检测到lncRNA-H19的特定结合蛋白;DDX-21和DDX3X是质谱分析中得到的主要结合蛋白,在紧接着的Western blot验证中,只有DDX3X被检测到。在这些结果中,进一步通过RNA免疫共沉淀技术,结果还显示在HTR-8/SVneo细胞中,H19只在蛋白水平上影响DDX3X的表达,而在m RNA水平上对DDX3X没有影响。4.本研究还发现,H19在滋养层细胞HTR-8/SVneo上影响DDX-3在Wnt-β-catenin通路中的激活过程,最终解释H19在组织和细胞水平上的作用机制。通过Western blot检测结果显示,过表达DDX3X后降调了E-cadherin的蛋白表达水平;进一步通过免疫荧光实验发现,在滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞中过表达DDX3X促进β-catenin从细胞膜向细胞核的转移定植,同时还明确了DDX3X对Wnt-β-catenin通路的激活作用;此外,免疫荧光实验进一步证实,lnc RNA-H19的上调表达中和了DDX3X在Wnt-β-catenin通路中的作用。研究结论1、长链非编码RNA H19在早期自然流产的绒毛组织中上调表达;2、LncRNA-H19的启动子区处于低甲基化状态及早期自然流产绒毛组织中全基因DNA甲基化水平降低;3、过表达lnc RNA-H19后对滋养层细胞的增殖和侵袭能力有一定的抑制作用;4、DDX-3X被认为是lncRNA-H19在滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞中的RNA结合蛋白;5、在人滋养层细胞中,lncRNA-H19影响DDX3X在Wnt-β-catenin通路中的激活过程。